Nuestro grupo de investigación utiliza las mitocondrias como diana farmacológica para el desarrollo de diferentes productos como quimioteropatos, insecticidas, entre otros. Con este vídeo queremos describir la metodología para evaluar las enzimas de la respiración mitocondrial de una forma más accesible, comprensible y utilizable. En nuestro laboratorio, hemos establecido un protocolo para evaluar los diferentes efectos de los xenobióticos en las mitocondrias en ratas, mosquitos y garrapatas, proporcionando algunas ideas sobre una respuesta mitocondrial específica.
Este enfoque apoya la formulación de plaguicidas bioseguros mediante la identificación de interrupciones bioenergéticas mitocondriales críticas para minimizar la toxicidad no objetivo. Nuestra ventaja diferencial incluye un protocolo de diseño de insecticidas que comienza con el análisis in silico de miles de moléculas, seguido de la validación in vitro de aquellas que cumplen con los criterios de bioseguridad, y concluye con pruebas in vivo. Este método ahorra tiempo y recursos al tiempo que se adhiere a las mejores prácticas en la producción de pesticidas.
A medio plazo, seleccionaremos moléculas de origen natural que puedan combinarse con la modificación genética, dirigiéndose a las mitocondrias de los insectos, con el objetivo de mejorar la especificidad y la bioseguridad en organismos no objetivo. Para empezar, prepare 250 mililitros de tampón de aislamiento de mitocondrias con o sin 0,2 gramos de BSA. Alícuota 10 mililitros del tampón en un tubo cónico helado.
Después de sacrificar a una rata, diseccione su hígado por completo y colóquelo en el tampón de aislamiento helado para enjuagarlo. Después de dos lavados, picar el tejido hepático con unas tijeras afiladas en una placa de Petri que contenga 10 mililitros de tampón de aislamiento. Coloque la solución en el tubo homogeneizador de tejido de Potter-Elvehjem para homogeneizar el tejido picado al menos 10 veces a una velocidad baja de 390 revoluciones por minuto.
A continuación, transfiera la solución homogeneizada a un tubo cónico y centrifuga a 600 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, vierta con cuidado el sobrenadante en un nuevo tubo cónico. Centrifugar de nuevo el sobrenadante a 7.000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante resultante.
Vuelva a suspender el pellet mitocondrial aislado en dos mililitros de tampón de aislamiento sin BSA. Verifique si los huevos de Aedes aegypti eclosionan en bandejas con agua decloración filtrada una semana antes del experimento, y monitoree el proceso de muda en las larvas. Una vez que las larvas alcancen la etapa L3, espere un máximo de 12 horas antes de recolectarlas.
Con una pipeta Pasteur, recoja al menos 100 larvas de Aedes aegypti en los estadios L3 a L4 en aproximadamente 30 mililitros de agua sin cloro. Después de filtrar, transfiera la solución con las larvas al tubo homogeneizador de tejidos Potter-Elvehjem y homogeneice cuidadosamente a aproximadamente 390 revoluciones por minuto al menos 10 veces. Transfiera el tejido homogeneizado a través de una jeringa de lana de vidrio para filtrar los residuos grandes del exoesqueleto.
Para empezar, obtener mitocondrias de hígado de rata y larvas de Aedes aegypti L3, L4 homogeneizadas. Para el ensayo polarográfico, calibre el respirómetro de alta resolución todos los días antes de comenzar cualquier ensayo, siguiendo las instrucciones del fabricante. Agregue medio de reacción a las cámaras, asegurando un exceso de al menos 0,2 mililitros por encima del volumen estándar de la cámara experimental de dos mililitros.
Controle el consumo de oxígeno para medir las actividades de NADH y succinato oxidasa después de agregar tampón de reacción, 0,1 miligramos de proteína y el sustrato. Espere hasta que la señal de concentración de oxígeno se estabilice y regístrese. Agregue inhibidores de proteínas transportadoras de electrones a la cámara para confirmar que el consumo de oxígeno observado se debe a la cadena respiratoria mitocondrial.
Para la actividad de la NADH deshidrogenasa, primero prepare el sistema de reacción que contenga todos los componentes necesarios y agregue los reactivos a la celda del espectrofotómetro. Monitorizar la actividad de la NADH deshidrogenasa con la reducción de ferrocianuro de potasio a 420 nanómetros. Utilice el coeficiente de extinción molar de 1,04 por milimolar por centímetro para calcular la concentración.
Finalmente, divida la actividad reportada por la concentración de proteína utilizada para obtener la actividad enzimática específica. Del mismo modo, evalúe la actividad de la succinato deshidrogenasa y la citocromo c reductasa o del complejo III utilizando mezclas de reacción adecuadas. Para medir la actividad de la citocromo c oxidasa o del complejo IV, prepare el sistema de reacción y mezcle cantidades molares iguales de citocromo c y ditionita de sodio, asegurando una reducción completa.
Pase la mezcla reducida a través de una columna de gel de dextrano reticulado utilizando el tampón de fosfato como fase móvil. Cuantificar las fracciones recogidas a 550 nanómetros en un espectrofotómetro. Por último, calcule la concentración con un coeficiente de extinción molar de 19,8 por milimolar por centímetro, aplicando la ley de Beer.
Divida la actividad reportada por la concentración de proteínas para obtener resultados de actividad enzimática específica. El cavactol, a 9,7 partes por millón, redujo la actividad de la NADH oxidasa en aproximadamente un 9,35%, mientras que el aceite esencial de Cymbopogon flexuosus, o EO, a 10 partes por millón, redujo la oxidación del NADH y la reducción del oxígeno en aproximadamente un 34%, lo que indica una inhibición en el transporte de electrones entre el Complejo I y el Complejo IV. y Cymbopogon flexuosus EO redujo la actividad de la succinato oxidasa hasta en un 50% en mitocondrias aisladas de hígado de rata, lo que sugiere una inhibición entre el Complejo II y el Complejo IV. El cavacrol disminuyó la actividad de la citocromo c reductasa de NADH y la oxidación del citocromo c y la reducción de oxígeno en el Complejo IV en larvas de Aedes aegypti, mientras que el AE de Cymbopogon flexuosus redujo la actividad de la citocromo c oxidasa en alrededor del 58% en las mitocondrias del hígado de rata.
