Notre groupe de recherche utilise les mitochondries comme cible pharmacologique pour le développement de différents produits tels que les chimiotétrapédies, les insecticides, entre autres. Avec cette vidéo, nous voulons décrire la méthodologie permettant d’évaluer les enzymes de la respiration mitochondriale d’une manière plus accessible, compréhensible et utilisable. Dans notre laboratoire, nous avons établi un protocole pour évaluer les différents effets des xénobiotiques sur les mitochondries chez les rats, les moustiques et les tiques, fournissant ainsi des informations sur une réponse mitochondriale spécifique.
Cette approche soutient la formulation de pesticides bio-sûrs en identifiant les perturbations bioénergétiques mitochondriales essentielles pour minimiser la toxicité non ciblée. Notre avantage différentiel comprend un protocole de conception d’insecticide qui commence par une analyse in silico de milliers de molécules, suivie d’une validation in vitro de celles qui répondent aux critères de biosécurité, et se termine par des tests in vivo. Cette méthode permet d’économiser du temps et des ressources tout en adhérant aux meilleures pratiques en matière de production de pesticides.
À moyen terme, nous sélectionnerons des molécules d’origine naturelle qui peuvent être combinées à une modification génétique, en ciblant les mitochondries d’insectes, en visant une spécificité et une biosécurité accrues chez les organismes non ciblés. Pour commencer, préparez 250 millilitres de tampon d’isolement des mitochondries avec ou sans 0,2 gramme de BSA. Aliquote 10 millilitres de tampon dans un tube conique glacé.
Après avoir euthanasié un rat, disséquez complètement son foie et placez-le dans le tampon d’isolement glacé pour le rincer. Après deux lavages, émincez le tissu hépatique avec des ciseaux bien aiguisés dans une boîte de Pétri contenant 10 millilitres de tampon d’isolement. Placez la solution dans le tube d’homogénéisation du tissu Potter-Elvehjem pour homogénéiser le tissu haché au moins 10 fois à une faible vitesse de 390 tours par minute.
Ensuite, transférez la solution homogénéisée dans un tube conique et centrifugez à 600 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, versez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube conique. Centrifugez à nouveau le surnageant à 7 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant obtenu.
Remettre en suspension la pastille mitochondriale isolée dans deux millilitres de tampon d’isolement sans BSA. Vérifiez si les œufs d’Aedes aegypti sont éclos dans des plateaux avec de l’eau déchlorée filtrée une semaine avant l’expérience, et surveillez le processus de mue chez les larves. Une fois que les larves atteignent le stade L3, attendez un maximum de 12 heures avant de les récolter.
À l’aide d’une pipette Pasteur, prélever au moins 100 larves d’Aedes aegypti aux stades L3 à L4 dans environ 30 millilitres d’eau sans chlore. Après la filtration, transférez la solution avec les larves dans le tube homogénéisateur de tissus Potter-Elvehjem et homogénéisez soigneusement à environ 390 tours par minute au moins 10 fois. Transférez le tissu homogénéisé à travers une seringue en laine de verre pour filtrer les gros résidus d’exosquelette.
Pour commencer, prélevez des mitochondries de foie de rat et des larves homogénéisées d’Aedes aegypti L3, L4. Pour le test polarographique, calibrez le respiromètre à haute résolution chaque jour avant de commencer tout test, en suivant les instructions du fabricant. Ajoutez du fluide réactionnel dans les chambres, en assurant un excès d’au moins 0,2 millilitre au-dessus du volume standard de la chambre expérimentale de deux millilitres.
Surveillez la consommation d’oxygène pour mesurer les activités du NADH et de la succinate oxydase après l’ajout d’un tampon de réaction, de 0,1 milligramme de protéines et du substrat. Attendez que le signal de concentration d’oxygène se stabilise et enregistrez-le. Ajoutez des inhibiteurs de protéines de transport d’électrons dans la chambre pour confirmer que la consommation d’oxygène observée est due à la chaîne respiratoire mitochondriale.
Pour l’activité de la NADH déshydrogénase, préparez d’abord le système réactionnel contenant tous les composants requis et ajoutez les réactifs dans la cellule du spectrophotomètre. Surveiller l’activité de la NADH déshydrogénase avec la réduction du ferrocyanure de potassium à 420 nanomètres. Utilisez le coefficient d’extinction molaire de 1,04 par millimolaire par centimètre pour calculer la concentration.
Enfin, divisez l’activité rapportée par la concentration en protéines utilisée pour obtenir l’activité enzymatique spécifique. De même, évaluer l’activité de la succinate déshydrogénase et de la cytochrome c réductase ou du complexe III à l’aide de mélanges réactionnels appropriés. Pour mesurer l’activité de la cytochrome c oxydase ou du complexe IV, préparez le système réactionnel et mélangez des quantités molaires égales de cytochrome c et de dithionite sodique, assurant ainsi une réduction complète.
Passez le mélange réduit à travers une colonne de gel de dextran réticulé en utilisant le tampon phosphate comme phase mobile. Quantifier les fractions collectées à 550 nanomètres dans un spectrophotomètre. Enfin, calculez la concentration avec un coefficient d’extinction molaire de 19,8 par millimolaire par centimètre, en appliquant la loi de Beer.
Divisez l’activité rapportée par la concentration en protéines pour obtenir des résultats spécifiques à l’activité enzymatique. Le cavacrol à 9,7 parties par million a réduit l’activité de la NADH oxydase d’environ 9,35 %, tandis que l’huile essentielle de Cymbopogon flexuose, ou OE, à 10 parties par million, a réduit l’oxydation du NADH et la réduction de l’oxygène d’environ 34 %, indiquant une inhibition du transport d’électrons entre le complexe I et le complexe IV. et l’HE de Cymbopogon flexuosus a réduit l’activité de la succinate oxydase jusqu’à 50 % dans les mitochondries hépatiques isolées du rat, suggérant une inhibition entre le complexe II et le complexe IV.Le cavacrol a diminué l’activité de la cytochrome c réductase du NADH et l’oxydation du cytochrome c et la réduction de l’oxygène au complexe IV chez les larves d’Aedes aegypti, tandis que l’HE de Cymbopogon flexuosus a réduit l’activité de la cytochrome c oxydase d’environ 58 % dans les mitochondries hépatiques de rat.
