نحن مهتمون باكتشاف آليات خلوية وجزيئية جديدة تتحكم في جذع الخلايا. هدفنا الرئيسي هو فك رموز كيفية تجنب الخلايا الجذعية التمايز في المنافذ. نظرا لأننا نعمل في ظل ظروف تجريبية ، فمن الضروري الحفاظ على سلامة الأنسجة لضمان حصول GSCs على سلوك فسيولوجي.
يحافظ بروتوكولنا على مكانة GSC صحية ووظيفية تتيح مراقبة تقسيم GSCs كما ستكون في الجسم الحي. يسمح لنا استخدام التصوير بعمر طويل بدراسة دورة الخلية بأكملها ل GSCs وديناميكيات الطيف. على وجه التحديد ، نجحنا في توصيف التغيرات الطيفية عبر دورة الخلية ، وهي مهمة كان من الصعب تحقيقها في السابق باستخدام الصور الثابتة أو فترات التصوير الأقصر.
إن معرفة كيفية إجراء التجارب بشكل أساسي دون التأثير على ديناميكياتها يسمح لنا باستكشاف كيفية تواصل الخلايا المتخصصة. نريد دراسة الآليات التنظيمية للتعبير الجيني والتمثيل الغذائي الخلوي بوساطة التفاعل المباشر بين mRNAs ، والإنزيمات الأيضية في بيولوجيا الخلايا الجذعية. للبدء ، قم بإعداد 100 ميكرولتر من مزيج المضادات الحيوية ستربتومايسين بنسلين بتركيز 10 ، 000 وحدة لكل مليلتر.
قم بإعداد جميع الكواشف الأخرى المطلوبة للإجراء وتخزينها بشكل مناسب. اجمع الذباب الذي يبلغ من العمر يوما إلى يومين يعبر عن الانتشار الموجود والتأسيسي الذي تم دمجه مع GFP في أنبوب جديد. استزراع الذباب لمدة يومين عند 25 درجة مئوية في حاضنة قبل التشريح.
ضع قطرة ثلاثة ميكرولتر من مادة Cell-Tak اللاصقة المحددة في وسط زلة الغطاء للوحة مطلية ب poly-D-lycine مقاس 35 ملم. أضف على الفور حجما متساويا من بيكربونات الصوديوم 0.1 مولار مع درجة حموضة ثمانية إلى قطرة لاصقة ثلاثة ميكرولتر. امزج المحلول مع ماصة.
للتبخر الكامل ، احتضن اللوحة بغطاءها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ثم قم بتخزين الطبق عند أربع درجات مئوية طوال الليل. بعد إذابة اللوحة في اليوم التالي ، اغسلها ثلاث مرات بستة ميكرولتر من الماء النقي للأوتوكلاف بعناية دون لمس الطبقة اللاصقة وإزعاجها.
دع الماء يتبخر تماما في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق. للبدء ، قم بزراعة الذباب وإعداد اللوحة السفلية الزجاجية بالطلاء. ثم قم بتنظيف طبق تشريح بثلاثة آبار وملقط وإبر تشريح بنسبة 70٪ من الإيثانول.
أضف ما يقرب من 200 ميكرولتر من محلول الرنين إلى كل من الآبار الثلاثة لطبق التشريح. باستخدام الملقط ، أمسك ذبابة الفاكهة الأنثوية عند تقاطع الصدر والبطن. قم بتمزيق البشرة برفق في البطن الخلفي واسحبها للخلف لكشف المبايض.
بعد تشريح المبايض ، انقلها إلى البئر التالي لتقليل التلوث ببقايا الأنسجة أو الحطام من التشريح. تحت مجهر استريو مع إضاءة LED ، استخدم زوجا واحدا من الملقط الدقيق لتثبيت المبيض بأكمله والزوج الثاني للاستيلاء على حجرة بيض في المرحلة المتأخرة. قم بالتمدد برفق حتى ينكسر غمد العضلات ويتأخر عن الركب.
باستخدام الملقط ، انقل المبيض الخالي من غمد العضلات من 15 إلى 20 مبيضا واحدا تلو الآخر إلى البئر الثالث الذي يحتوي على 200 ميكرولتر من وسط الرنين. قم ببلل طرف سعة 200 ميكرولتر مسبقا مع 0.1٪ Tween 20 لمنع المبيض من الالتصاق بجدار الطرف. انقل ستة ميكرولترات من محلول الرنين الذي يحتوي على المبايض الخالية من غمد العضلات باستخدام الطرف المبلل مسبقا إلى الصفيحة اللاصقة المحضرة في درجة حرارة الغرفة.
باستخدام إبرة تشريح أو ملقط ، اضغط بعناية على المبايض إلى أسفل قطرة الرنين لضمان ملامسة السطح اللاصق. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلتر من وسط شنايدر ، مكملا بمزيج المضادات الحيوية 15٪ FBS و 0.6٪ من الستربتومايسين البنسلين إلى لوحة MatTek. انقل اللوحة التي تحتوي على المبايض الخالية من غمد العضلات على سطح مستو إلى محطة المجهر.
ضع اللوحة على هدف 63x لمجهر قرص دوار أو مجهر متحد البؤر. ركز العينة وحدد المستوى Z الأوسط لكل جرمانيوم. لتكوين المعلمات التجريبية، قم بتعيين نوع الالتقاط إلى 3D Timelapse.
اضبط طاقة الليزر على 70٪ من الحد الأقصى. اضبط الطول الموجي للإثارة على 488 نانومتر. يتراوح مكدس Z إلى 30 ميكرومتر والمسافة بين مكدسات Z إلى 1.2 ميكرومتر.
اضبط الفاصل الزمني بين النقاط الزمنية على كل 10 دقائق والمدة على 17 ساعة. إذا كان ذلك متاحا، فاستخدم الخيار متعدد المواضع لإعادة تعريف XY للعينات. حدد المستوى Z في منتصف كل جرامر بحيث يتم توسيط مداخن Z في هذا الموضع وبدء الاستحواذ.
قم بتحليل الصور في الوقت المناسب وعلى طول المحور Z لتصور التغييرات في مورفولوجيا الطيف باستخدام برنامج Imaris أو Image J. لإنشاء الأفلام ، حدد يدويا أفضل مستوى Z في كل نقطة زمنية. تم تقليل إشارة GFP القوية لمنطقة الطيف المستديرة G2 بشكل كبير خلال مراحل G2 MG1.
خلال الطور الأولي المبكر ، غادر GFP المعدل الأول الجسيم الطيفي وملأ السيتوبلازم مما يشير إلى دخول الخلايا الجذعية الجرثومية إلى الانقسام. بعد الانقسام والغلاف النووي ، تعافت إشارة GFP par one تدريجيا في دورة G1 Spectro المستديرة. أدت طبعة Denovo من GFP على قدم المساواة مع الطيف المستدير G1 إلى تكوين أشكال الطيف القابس والقضيب والصهر.
