Wir sind daran interessiert, neue zelluläre und molekulare Mechanismen zu entdecken, die die Stammzellen von Zellen steuern. Unser Hauptziel ist es, zu entschlüsseln, wie Stammzellen eine Differenzierung in den Nischen vermeiden. Da wir unter experimentellen Bedingungen arbeiten, ist es wichtig, die Integrität des Gewebes zu erhalten, um sicherzustellen, dass GSCs ein physiologisches Verhalten erhalten.
Unser Protokoll behält eine gesunde und funktionale GSC-Nische bei, die die Überwachung von sich teilenden GSCs ermöglicht, wie sie in vivo sein würden. Der Einsatz von Extended Life Imaging ermöglicht es uns, den gesamten Zellzyklus von GSCs und die Spektrosomendynamik zu untersuchen. Konkret gelingt es uns, die Veränderungen des Spektrosoms über den Zellzyklus hinweg zu charakterisieren, eine Aufgabe, die bisher mit festen Bildern oder kürzeren Bildgebungszeiträumen nur schwer zu bewerkstelligen war.
Wenn wir wissen, wie man hauptsächlich Experimente durchführt, ohne die Dynamik zu beeinflussen, können wir erforschen, wie die Nischenzellen kommunizieren. Wir wollen regulatorische Mechanismen der Genexpression und des zellulären Stoffwechsels untersuchen, die durch direkte Interaktion zwischen mRNAs, Stoffwechselenzymen in der Biologie der Stammzellen, vermittelt werden. Bereiten Sie zunächst 100 Mikroliter Aliquots der Streptomycin-Penicillin-Antibiotikamischung in einer Konzentration von 10.000 Einheiten pro Milliliter vor.
Bereiten Sie alle anderen erforderlichen Reagenzien für den Eingriff vor und lagern Sie sie entsprechend. Sammeln Sie ein bis zwei Tage alte Fliegen, die das ubiquitär und konstitutiv exprimierte par one exprimieren, das mit GFP fusioniert ist, in einer neuen Tube. Kultivieren Sie die Fliegen zwei Tage lang bei 25 Grad Celsius in einem Inkubator, bevor Sie sie sezieren.
Geben Sie einen drei Mikroliter des speziellen Cell-Tak-Klebstoffs in die Mitte des Deckglases einer 35 Millimeter dicken, mit Poly-D-Lyzin beschichteten Platte. Geben Sie sofort ein gleiches Volumen von 0,1 molaren Natriumbicarbonat mit einem pH-Wert von acht zu dem drei Mikroliter Klebetropfen. Mischen Sie die Lösung mit einer Pipette.
Für eine vollständige Verdunstung inkubieren Sie die Platte mit dem Deckel 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Anschließend die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Nach dem Auftauen der Platte am nächsten Tag waschen Sie sie dreimal vorsichtig mit sechs Mikrolitern reinem Autoklavenwasser, ohne die Klebeschicht zu berühren und zu stören.
Lassen Sie das Wasser fünf bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur vollständig verdunsten. Zu Beginn kultivieren Sie die Fliegen und bereiten Sie die Glasbodenplatte mit der Beschichtung vor. Reinigen Sie dann eine Dissektionsschale mit drei Vertiefungen, eine Pinzette und eine Präpariernadel mit 70% Ethanol.
Geben Sie etwa 200 Mikroliter Ringerlösung in jede der drei Vertiefungen der Sezierschale. Fassen Sie das Drosophila-Weibchen mit einer Pinzette an der Schnittstelle von Thorax und Bauch. Reißen Sie die Nagelhaut am hinteren Bauch vorsichtig ab und ziehen Sie sie zurück, um die Eierstöcke freizulegen.
Nachdem Sie die Eierstöcke präpariert haben, übertragen Sie sie in die nächste Vertiefung, um eine Kontamination mit Geweberesten oder Ablagerungen aus der Sektion zu reduzieren. Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop mit LED-Beleuchtung eine feine Pinzette, um den gesamten Eierstock zu verankern, und das zweite Paar, um eine Eikammer im späten Stadium zu greifen. Dehnen Sie sich sanft, bis die Muskelhülle reißt und zurückbleibt.
Übertragen Sie die 15 bis 20 muskelscheidenfreien Eierstöcke mit einer Pinzette nacheinander in die dritte Vertiefung mit 200 Mikrolitern Ringermedium. Befeuchten Sie eine 200-Mikroliter-Spitze mit 0,1 % Tween 20, um zu verhindern, dass die Eierstöcke an der Spitzenwand kleben. Übertragen Sie sechs Mikroliter Ringerlösung, die die muskelscheidenfreien Eierstöcke enthält, mit der vorbenetzten Spitze bei Raumtemperatur auf die vorbereitete Klebeplatte.
Drücken Sie die Eierstöcke mit einer Präpariernadel oder Pinzette vorsichtig auf den Boden des Tropfens, um den Kontakt mit der Klebefläche zu gewährleisten. Geben Sie anschließend drei Milliliter Schneider-Medium, ergänzt mit 15 % FBS und 0,6 % Streptomycin-Penicillin-Antibiotika-Mischung, auf die MatTek-Platte. Transportieren Sie die Platte mit den muskelscheidenfreien Eierstöcken auf einer ebenen Fläche zur Mikroskopstation.
Platzieren Sie die Platte auf dem 63-fach-Objektiv eines Spinning-Disc-Mikroskops oder eines Konfokalmikroskops. Fokussieren Sie die Probe und wählen Sie die mittlere Z-Ebene für jedes Germanium aus. Um die experimentellen Parameter zu konfigurieren, legen Sie den Aufnahmetyp auf 3D-Zeitraffer fest.
Stellen Sie die Laserleistung auf 70 % des Maximums ein. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 488 Nanometer ein. Der Z-Stapelbereich reicht bis 30 Mikrometer und der Abstand zwischen den Z-Stapeln bis zu 1,2 Mikrometern.
Legen Sie das Intervall zwischen den Zeitpunkten auf alle 10 Minuten und die Dauer auf 17 Stunden fest. Falls verfügbar, verwenden Sie die Option für mehrere Positionen, um den XY-Wert der Proben neu zu definieren. Wählen Sie die Z-Ebene in der Mitte jedes Germariums aus, so dass die Z-Stapel an dieser Position zentriert werden, und starten Sie die Erfassung.
Analysieren Sie die Bilder zeitlich und entlang der Z-Achse, um Änderungen in der Spektrosomenmorphologie mit der Software Imaris oder Image J zu visualisieren. Um die Filme zu erstellen, wählen Sie manuell die beste Z-Ebene zu jedem Zeitpunkt aus. Das starke GFP-Par-Eins-Signal der runden G2-Spektrozone war während der G2 MG1-Phasen signifikant reduziert.
Während der frühen Prophase verließ GFP par 1 das Spektrosom und füllte das Zytoplasma, was den Eintritt der Keimbahnstammzellen in die Mitose anzeigt. Nach der Mitose und der Reformation der Kernhülle erholte sich das GFP-Par-1-Signal allmählich im runden G1-Spektrozyklus. Die Denovo-Edition von GFP par one zum runden G1-Spektrosom führte zur Bildung von Plug-, Bar- und Fusing-Spektrosomen-Morphologien.
