私たちは、細胞の幹細胞性を制御する新しい細胞および分子メカニズムを発見することに興味を持っています。私たちの主な目的は、幹細胞がニッチでの分化をどのように回避するかを解読することです。私たちは実験条件下で研究しているため、GSCが生理学的挙動を確実に受けられるように、組織の完全性を保つことが不可欠です。
私たちのプロトコルは、健全で機能的なGSCニッチを維持し、in vivoで分裂するGSCのモニタリングを可能にします。長寿命イメージングを用いることで、GSCの細胞周期全体と分光体ダイナミクスを研究することができます。具体的には、これまで固定画像や短いイメージング期間では達成が難しかった、細胞周期全体にわたるスペクトロソームの変化を特徴づけることに成功しました。
ダイナミクスに影響を与えずに主に実験を行う方法を知ることで、ニッチ細胞がどのように通信するかを探求することができます。私たちは、幹細胞の生物学における代謝酵素であるmRNA間の直接的な相互作用によって媒介される遺伝子発現と細胞代謝の制御機構を研究したいと考えています。はじめに、ストレプトマイシンペニシリン抗生物質混合物の100マイクロリットルアリコートを1ミリリットルあたり10, 000単位の濃度で調製します。
その他、手順に必要な試薬をすべて準備し、適切に保管してください。ユビキタスに発現し、構成的に発現したパーワンを新しいチューブに融合させた1〜2日齢のハエを収集します。ハエをインキュベーターで摂氏25度で2日間培養してから解剖します。
35 mmポリD-リシンコーティングプレートのカバースリップの中央に、特定のCell-Tak接着剤を3マイクロリットル滴下します。すぐに、pH 8の等量0.1モル重炭酸ナトリウムを3マイクロリットルの接着剤ドロップに加えます。溶液をピペットで混合します。
完全に蒸発させるには、プレートをカバー付きで室温で20分間インキュベートします。その後、プレートを摂氏4度で一晩保管します。翌日プレートを解凍した後、接着剤層に触れたり乱したりしないように、6マイクロリットルのオートクレーブ純水で3回丁寧に洗浄します。
室温で5〜10分間水を完全に蒸発させます。まず、ハエを培養し、コーティングを施したガラスの底板を準備します。次に、3ウェル解剖皿、鉗子、解剖針を70%エタノールで洗浄します。
解剖皿の3つのウェルのそれぞれに約200マイクロリットルのリンガー溶液を追加します。鉗子を使用して、胸部と腹部の交差点でショウジョウバエの女性をつかみます。後腹部のキューティクルをそっと引き裂き、引き戻して卵巣を露出させます。
卵巣を解剖した後、組織残骸や解剖からの破片による汚染を減らすために、卵巣を次のウェルに移します。LED照明付きの実体顕微鏡下で、1組の細い鉗子を使用して卵巣全体を固定し、2組目を使用して後期卵室をつかみます。筋肉鞘が壊れて遅れるまで、やさしくストレッチします。
鉗子を使用して、15〜20個の筋肉鞘のない卵巣を1つずつ、200マイクロリットルのリンガー培地を含む3番目のウェルに移します。200マイクロリットルの先端を0.1%Tween 20で事前に濡らして、卵巣が先端壁にくっつくのを防ぎます。筋肉鞘のない卵巣を含む6マイクロリットルのリンガー溶液を、事前に濡らした先端を使用して、室温で準備した接着プレートに移します。
解剖針または鉗子を使用して、卵巣をリンガードロップの底に慎重に押し込み、接着面との接触を確保します。次に、15%FBSと0.6%ストレプトマイシンペニシリン抗生物質ミックスを添加したシュナイダーの培地を3ミリリットル加えます。筋肉鞘のない卵巣を平らな面に載せたプレートを顕微鏡ステーションに運びます。
プレートをスピニングディスク顕微鏡または共焦点顕微鏡の63倍対物レンズに置きます。サンプルの焦点を合わせ、各ゲルマニウムの中央のZ平面を選択します。実験パラメータを設定するには、キャプチャタイプを3Dタイムラプスに設定します。
レーザー出力を最大70%に調整します。励起波長を488ナノメートルに設定します。Zスタックの範囲は30マイクロメートル、Zスタック間の距離は1.2マイクロメートルです。
タイムポイントの間隔を 10 分ごとに設定し、期間を 17 時間に設定します。可能な場合は、マルチポジションオプションを使用してサンプルのXYを再定義します。各ゲルマリウムの中央にあるZ平面を選択して、Zスタックがこの位置の中央に配置され、取得を開始します。
ImarisまたはImage Jソフトウェアを使用して、画像を時間内およびZ軸に沿って解析し、分光体形態の変化を視覚化します。ムービーを作成するには、各時点で最適な Z 平面を手動で選択します。丸いG2スペクトロゾーンの強いGFPパー1シグナルは、G2 MG1フェーズで大幅に減少しました。
初期の前期GFPパー1はスペクトロソームを離れて細胞質を満たし、生殖細胞系幹細胞が有糸分裂に入ることを示しています。有糸分裂と核膜の再構築後、GFPパーワンの信号は丸いG1スペクトロサイクルで徐々に回復しました。丸いG1スペクトロソームにGFPパー1のDenovo版は、プラグ、バー、および融合スペクトロソームの形態の形成につながりました。
