Estamos interesados en descubrir nuevos mecanismos celulares y moleculares que controlan la madre de las células. Nuestro objetivo principal es descifrar cómo las células madre evitan la diferenciación en los nichos. Dado que estamos trabajando en condiciones experimentales, es esencial preservar la integridad de los tejidos para garantizar que las GSC reciban un comportamiento fisiológico.
Nuestro protocolo mantiene un nicho de GSC saludable y funcional que permite el seguimiento de las GSC divididas tal y como serían in vivo. El uso de imágenes de vida extendida nos permite estudiar todo el ciclo celular de las GSC y la dinámica de los espectrosomas. Específicamente, caracterizamos con éxito los cambios en el espectro a lo largo del ciclo celular, una tarea que anteriormente era difícil de lograr con imágenes fijas o períodos de imagen más cortos.
Saber realizar principalmente experimentos sin afectar su dinámica nos permite explorar cómo se comunican las células de nicho. Queremos estudiar los mecanismos reguladores de la expresión génica y el metabolismo celular mediados por la interacción directa entre ARNm, enzimas metabólicas en la biología de las células madre. Para comenzar, prepare 100 alícuotas de microlitros de la mezcla antibiótica de penicilina estreptomicina a una concentración de 10, 000 unidades por mililitro.
Prepare todos los demás reactivos necesarios para el procedimiento y guárdelos adecuadamente. Recoja moscas de uno o dos días de edad que expresen el par uno expresado de manera ubicua y constitutiva fusionadas con GFP en un nuevo tubo. Cultive las moscas durante dos días a 25 grados centígrados en una incubadora antes de la disección.
Coloque una gota de tres microlitros del adhesivo específico Cell-Tak en el centro del cubreobjetos de una placa recubierta de poli-D-licina de 35 milímetros. Agregue inmediatamente un volumen igual de bicarbonato de sodio 0,1 molar con un pH de ocho a la gota adhesiva de tres microlitros. Mezcle la solución con una pipeta.
Para una evaporación completa, incube la placa con su tapa a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego guarde el plato a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de descongelar la placa al día siguiente, lávela tres veces con seis microlitros de agua pura de autoclave cuidadosamente sin tocar ni alterar la capa adhesiva.
Deje que el agua se evapore completamente a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos. Para comenzar, cultive las moscas y prepare la placa inferior de vidrio con el recubrimiento. A continuación, limpie un plato de disección de tres pocillos, pinzas y agujas de disección con etanol al 70%.
Agregue aproximadamente 200 microlitros de solución de timbre a cada uno de los tres pocillos de la placa de disección. Con fórceps, agarra a la hembra de Drosophila en la intersección del tórax y el abdomen. Rasga suavemente la cutícula en la parte posterior del abdomen y tira de ella hacia atrás para exponer los ovarios.
Después de diseccionar los ovarios, transfiéralos al siguiente pocillo para reducir la contaminación con restos de tejido o desechos de la disección. Bajo un microscopio estereoscópico con iluminación LED, use un par de pinzas finas para anclar todo el ovario y el segundo par para agarrar una cámara de óvulos en etapa tardía. Estírese suavemente hasta que la vaina muscular se rompa y se quede atrás.
Con ayuda de pinzas, transfiera los 15 a 20 ovarios sin vaina muscular uno por uno al tercer pocillo que contiene 200 microlitros de medio de timbre. Humedecer previamente una punta de 200 microlitros con 0,1%Tween 20 para evitar que las ováricas se peguen a la pared de la punta. Transfiera seis microlitros de solución de timbre que contiene los ovarios sin vaina muscular utilizando la punta prehumedecida a la placa adhesiva preparada a temperatura ambiente.
Con una aguja de disección o pinzas, presione con cuidado las ováricas hasta el fondo de la gota del timbre para asegurar el contacto con la superficie adhesiva. A continuación, agregue tres mililitros del medio de Schneider, complementado con una mezcla de antibióticos de penicilina con 15% de FBS y 0,6% de estreptomicina a la placa MatTek. Transporte la placa que contiene los ovarios sin vaina muscular sobre una superficie plana a la estación de microscopio.
Coloque la placa en el objetivo de 63x de un microscopio de disco giratorio o un microscopio confocal. Enfoque la muestra y seleccione el plano Z central para cada germanio. Para configurar los parámetros experimentales, establezca el tipo de captura en Lapso de tiempo 3D.
Ajuste la potencia del láser al 70% del máximo. Establezca la longitud de onda de excitación en 488 nanómetros. El rango de la pila Z es de 30 micrómetros y la distancia entre las pilas Z es de 1,2 micrómetros.
Establezca el intervalo entre puntos de tiempo en cada 10 minutos y la duración en 17 horas. Si está disponible, utilice la opción de varias posiciones para redefinir el XY de las muestras. Seleccione el plano Z en el centro de cada germarium para que las pilas Z se centren en esta posición y comiencen la adquisición.
Analice las imágenes en el tiempo y a lo largo del eje Z para visualizar los cambios en la morfología del espectrosoma utilizando el software Imaris o Image J. Para crear las películas, seleccione manualmente el mejor plano Z en cada punto de tiempo. La fuerte señal GFP par uno de la zona espectral redonda G2 se redujo significativamente durante las fases G2 MG1.
Durante la profase temprana, la GFP par uno abandonó el espectrosoma y llenó el citoplasma, lo que indica la entrada de las células madre de la línea germinal en la mitosis. Después de la mitosis y la reformación de la envoltura nuclear, la señal GFP par uno se recuperó gradualmente en el ciclo redondo G1 Spectro. La edición Denovo de GFP par uno al espectrosoma redondo G1 condujo a la formación de morfologías de espectrosoma de tapón, barra y fusión.
