ينصب التركيز الأساسي لمختبرنا على تحديد الآليات الكامنة وراء تجديد الجهاز العصبي المركزي للثدييات باستخدام الكائن الحي النموذجي ، C.elegans. ندرس التجديد عبر الخلايا العصبية المتعددة ونبحث عن هوية إشارة التكييف المسبق التي تؤدي إلى تعزيز تجديد الجهاز العصبي المركزي. تشمل التحديات التجريبية الحالية إدخال فقاعات الهواء أثناء استبدال اللوح الزجاجي على سجل الفينيل والحصول على سمك قالب موحد.
ومع ذلك ، بمجرد إنشاء قالب PDMS ، يمكن إعادة استخدامه للفكين. الفجوة البحثية التي نعالجها هي سيطرة محدودة على اتجاه البالغة. البالغة أكبر في القطر وتكون أكثر صبغة مما يتسبب في حدوث مشكلات في التصوير في طائرات Z الأعمق.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن مقدمة زلة الغطاء تغير أيضا الاتجاه الأولي. تساعد القنوات في الحفاظ على اتجاه عند إدخال زلة الغطاء ، مما يسمح للخلايا المستهدفة بأن تكون أقرب إلى هدف التصوير. تقلل القنوات أيضا من الضغط على التي تعزز علم وظائف الأعضاء الطبيعي ، وتشجع التكوين الخطي للحيوانات ، وتخلق الاتساق عند التصوير عبر متعددة.
للبدء ، اسكب نسبة واحدة إلى 10 من عامل المعالجة السريع إلى القاعدة في طبق وزن يمكن التخلص منه. اخلطي السائل غير المعالج جيدا لمدة 45 ثانية حتى يتجانس تماما ويمتلئ بالفقاعات. ثم ضع الصينية التي تحتوي على خليط PDMS غير المعالج في مجفف مفرغ من الهواء عند إمالة.
قم بتدوير الضغط بين سالب 0.09 كيلو باسكال و0.1 كيلو باسكال تحت الصفر ثلاث مرات للسماح لفقاعات الهواء بالظهور. اشطف سجل الفينيل واللوح الزجاجي جيدا بالماء منزوع الأيونات ، واترك سجل الفينيل يجف تماما في الهواء قبل الاستخدام مرة أخرى. ضع ورقة من رقائق الألومنيوم فوق اللوح الساخن لالتقاط أي PDMS زائد.
ثم ضع شريحة زجاجية في كل طرف من طرفي سجل الفينيل لضبط سمك القالب ، مما يضمن ارتفاعا موحدا عند الضغط على اللوح الزجاجي على نظام PDMS غير المعالج. الآن ، اسكب سائل PDMS غير المعالج على جانب واحد من سجل الفينيل. قم بإمالة اللوح الزجاجي وإسقاطه ببطء للسماح للهواء المحبوس بالخروج.
ثم عالج PDMS عند 100 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بإزالة سجل الفينيل من اللوح الساخن واتركه ليبرد. بعد ذلك ، قم بتقشير PDMS بعناية من سجل الفينيل لتجنب التمزق.
ثم قشر PDMS من اللوح الزجاجي. باستخدام شريحة زجاجية جديدة كدليل ، قم بقص PDMS بشفرة حلاقة حادة لإنشاء قالب أجار موجه. قشر PDMS الزائد لإظهار قالب أجار الموجه النهائي.
أضف 0.6 جرام من أجار و 30 مل من المرق السائل المتوسط لنمو الديدان الخيطية في قارورة. ضعي لوح التقليب في القارورة وسخني المزيج على طبق ساخن ، واضبطيه على 120 درجة مئوية. أضف 120 ميكرولترا من محلول مخزون أزيد الصوديوم بعد ذوبان الجل.
ثم اغسل قالب PDMS جيدا بالماء واتركه يجف في الهواء. ضع قالب PDMS بين مجموعتين من أزواج الشرائح للتحضير للاستخدام. باستخدام ماصة، اسحب محلول الأجار لأعلى ولأسفل لتسخين طرف الماصة وقم بوضع 300 ميكرولتر من الأجار المذاب على قالب PDMS.
أخيرا ، ضع شريحة مجهرية مباشرة على الأجار ، مع التأكد من وضعها على الشرائح على الجانبين. قم بإزالة الشريحة بعد أن يبرد الأجار تماما. سهلت وسادات الأجار الموجهة التوجيه الدقيق ل Caenorhabditis elegans عن طريق دحرجة لمحاذاة المعالم ، مثل الفرج والأمعاء على شكل حرف S ، والتي تم التحقق منها تحت مجهر تشريح الفلورسنت قبل نقلها إلى المجهر المقلوب.
تحقق التصوير الفلوري من الاتجاه الصحيح ل Caenorhabditis elegans على وسادات أجار الموجهة كما هو موضح في الصور المجهرية الفلورية. تعمل وسادات أجار الموجهة على تحسين جودة التصوير لتجديد الخلايا العصبية عن طريق وضع ألياف الخلايا العصبية المتجددة بالقرب من العدسة الشيئية ، مما يقلل من تشتت الضوء وامتصاصه.
