L’objectif principal de notre laboratoire est de définir les mécanismes sous-jacents à la régénération du système nerveux central des mammifères à l’aide de l’organisme modèle, C. elegans. Nous étudions la régénération à travers plusieurs neurones et recherchons l’identité du signal de préconditionnement qui conduit à une régénération accrue du système nerveux central. Les défis expérimentaux actuels comprennent l’introduction de bulles d’air lors du remplacement de la plaque de verre sur le disque vinyle et l’obtention d’une épaisseur de moule uniforme.
Cependant, une fois le moule PDMS créé, il peut être réutilisé pour les mâchoires. L’écart de recherche que nous abordons est le contrôle limité de l’orientation des animaux adultes. Les animaux adultes ont un diamètre plus grand et sont plus pigmentés, ce qui pose des problèmes d’imagerie dans les plans Z plus profonds.
De plus, l’introduction du bordereau de couverture modifie également l’orientation initiale. Les canaux aident à maintenir l’orientation des animaux lors de l’introduction de la lamelle, ce qui permet aux cellules cibles d’être plus proches de l’objectif pour l’imagerie. Les canaux réduisent également le stress sur les animaux, favorisant une physiologie normale, encourageant la configuration linéaire des animaux et créant une cohérence lors de l’imagerie sur plusieurs animaux.
Pour commencer, versez un rapport de un à 10 de l’agent de durcissement rapide à la base dans un plat de pesée jetable. Mélangez soigneusement le liquide non durci pendant 45 secondes jusqu’à ce qu’il soit complètement intégré et plein de bulles. Placez ensuite le plateau contenant le mélange PDMS non durci dans un dessiccateur sous vide incliné.
Réglez la pression entre moins 0,09 kilo pascal et moins 0,1 kilo pascal trois fois pour permettre aux bulles d’air de faire surface. Rincez abondamment le disque vinyle et la plaque de verre avec de l’eau déminéralisée et laissez le disque vinyle sécher complètement à l’air libre avant de l’utiliser à nouveau. Placez une feuille de papier d’aluminium sur la plaque chauffante pour récupérer tout excès de PDMS.
Placez ensuite une lame de verre à chaque extrémité du disque vinyle pour régler l’épaisseur du moule, en assurant une hauteur uniforme lors de la pression de la vitre sur le PDMS non polymérisé. Maintenant, versez le liquide PDMS non durci sur une face du disque vinyle. Inclinez la plaque de verre et abaissez-la lentement pour permettre à l’air emprisonné de s’échapper.
Ensuite, durcissez le PDMS à 100 degrés Celsius pendant 20 minutes. Retirez le disque vinyle de la plaque chauffante et laissez-le refroidir. Après cela, décollez soigneusement le PDMS du disque vinyle pour éviter de le déchirer.
Décollez ensuite le PDMS de la vitre. À l’aide d’une nouvelle lame de verre comme guide, coupez le PDMS avec un rasoir bien aiguisé pour créer un moule à gélose canalisé. Pelez l’excédent de PDMS pour montrer le moule de gélose canalisé de coupe finale.
Ajouter 0,6 gramme de gélose et 30 millilitres de bouillon liquide de milieu de croissance des nématodes dans un flacon. Placez une barre d’agitation dans le ballon et faites chauffer le mélange sur une plaque chauffante, réglée à 120 degrés Celsius. Ajoutez 120 microlitres de solution mère d’azoture de sodium après la fonte du gel.
Ensuite, lavez soigneusement le moule PDMS avec de l’eau et laissez-le sécher à l’air. Placez le moule PDMS entre deux ensembles de paires de lames pour préparer l’utilisation. À l’aide d’une pipette, aspirez la solution de gélose de haut en bas pour réchauffer la pointe de la pipette et pipetez 300 microlitres de gélose fondue sur le moule PDMS.
Enfin, placez une lame de microscope directement sur la gélose, en vous assurant qu’elle repose sur les lames sur les côtés. Retirez la lame une fois que la gélose a complètement refroidi. Des coussinets de gélose canalisés ont facilité l’orientation précise de Caenorhabditis elegans en faisant rouler l’animal pour aligner des points de repère, tels que la vulve et l’intestin en forme de S, vérifiés au microscope de dissection fluorescente avant de passer à un microscope inversé.
L’imagerie fluorescente a vérifié l’orientation correcte de Caenorhabditis elegans sur les tampons gélifiés canalisés, comme le montrent les micrographies fluorescentes. Les tampons gélosés canalisés ont amélioré la qualité de l’imagerie pour la régénération neuronale en positionnant les fibres neuronales régénérées plus près de la lentille de l’objectif, minimisant ainsi la diffusion et l’absorption de la lumière.
