L'obiettivo principale del nostro laboratorio è definire i meccanismi alla base della rigenerazione del sistema nervoso centrale dei mammiferi utilizzando l'organismo modello, C.elegans. Studiamo la rigenerazione in più neuroni e cerchiamo l'identità del segnale di precondizionamento che porta a una maggiore rigenerazione del sistema nervoso centrale. Le attuali sfide sperimentali includono l'introduzione di bolle d'aria durante la sostituzione della lastra di vetro sul disco in vinile e l'ottenimento di uno spessore uniforme dello stampo.
Tuttavia, una volta creato lo stampo PDMS, può essere riutilizzato per le ganasce. Il divario di ricerca che stiamo affrontando è il controllo limitato sull'orientamento degli animali adulti. Gli animali adulti hanno un diametro maggiore e sono più pigmentati, causando problemi per l'imaging nei piani Z più profondi.
Inoltre, l'introduzione del vetrino coprioggetto modifica anche l'orientamento iniziale. I canali aiutano a mantenere l'orientamento degli animali al momento dell'introduzione del vetrino, consentendo alle cellule bersaglio di essere più vicine all'obiettivo per l'imaging. I canali riducono anche lo stress sugli animali, promuovendo la normale fisiologia, incoraggiando la configurazione lineare degli animali e creando coerenza durante l'imaging su più animali.
Per iniziare, versare un rapporto da uno a 10 dell'agente di polimerizzazione rapida alla base in un piatto di pesata usa e getta. Mescolare accuratamente il liquido non polimerizzato per 45 secondi fino a quando non è completamente integrato e pieno di bolle. Quindi posizionare il vassoio contenente la miscela PDMS non polimerizzata in un essiccatore sottovuoto inclinato.
Ciclizzare la pressione tra meno 0,09 kilopascal e meno 0,1 kilopascal tre volte per consentire alle bolle d'aria di emergere. Sciacquare accuratamente il disco in vinile e la lastra di vetro con acqua deionizzata e lasciare asciugare completamente il disco in vinile all'aria prima di un ulteriore utilizzo. Posizionare un foglio di carta stagnola sopra la piastra riscaldante per raccogliere l'eccesso di PDMS.
Quindi posizionare un vetrino a ciascuna estremità del disco in vinile per impostare lo spessore dello stampo, garantendo un'altezza uniforme quando si preme la lastra di vetro sul PDMS non polimerizzato. Ora, versa il liquido PDMS non polimerizzato su un lato del disco in vinile. Inclinare la lastra di vetro e abbassarla lentamente per consentire la fuoriuscita dell'aria intrappolata.
Quindi polimerizzare il PDMS a 100 gradi Celsius per 20 minuti. Togliete il disco in vinile dalla piastra riscaldante e lasciatelo raffreddare. Successivamente, staccare con cura il PDMS dal disco in vinile per evitare strappi.
Quindi staccare il PDMS dal vetro. Utilizzando un nuovo vetrino come guida, tagliare il PDMS con un rasoio affilato per creare uno stampo per agar canalizzato. Sbucciare il PDMS in eccesso per mostrare lo stampo di agar canalizzato tagliato finale.
Aggiungere 0,6 grammi di agar e 30 millilitri di brodo liquido per la crescita dei nematodi in un pallone. Mettere una barretta di cottura nel pallone e scaldare il composto su una piastra calda, impostata a 120 gradi Celsius. Aggiungere 120 microlitri di soluzione madre di sodio azide dopo che il gel si è sciolto.
Quindi lavare accuratamente lo stampo PDMS con acqua e lasciarlo asciugare all'aria. Posizionare lo stampo PDMS tra due serie di coppie di diapositive per prepararsi all'uso. Utilizzando una pipetta, aspirare la soluzione di agar su e giù per riscaldare il puntale della pipetta e pipettare 300 microlitri di agar fuso sullo stampo PDMS.
Infine, posizionare un vetrino da microscopio direttamente sull'agar, assicurandosi che poggi sui vetrini ai lati. Rimuovere il vetrino dopo che l'agar si è completamente raffreddato. I cuscinetti di agar canalizzati hanno facilitato l'orientamento preciso di Caenorhabditis elegans facendo rotolare l'animale per allineare i punti di riferimento, come la vulva e l'intestino a forma di S, verificati con un microscopio da dissezione fluorescente prima di trasferirlo a un microscopio invertito.
L'imaging fluorescente ha verificato il corretto orientamento di Caenorhabditis elegans sui cuscinetti di agar canalizzati, come mostrato nelle micrografie fluorescenti. I cuscinetti di agar canalizzati hanno migliorato la qualità dell'imaging per la rigenerazione neuronale posizionando le fibre dei neuroni rigenerati più vicino alla lente dell'obiettivo, riducendo al minimo la dispersione e l'assorbimento della luce.
