イメージング神経再生のためのチャネル寒天パッド上の 線虫 の配向の微調整

当研究室では、モデル生物であるC.elegansを用いて、哺乳類の中枢神経系再生のメカニズムを解明することに注力しています。私たちは、複数のニューロンにわたる再生を研究し、中枢神経系の再生を促進するプレコンディショニングシグナルの正体を探ります。現在の実験課題は、ビニールレコードのガラス板を交換させながら気泡を導入し、均一な型厚を得ることです。

ただし、PDMSの金型は一度作成すると、ジョーに再利用できます。私たちが取り組んでいる研究のギャップは、成体動物の向きに対する制御が限られていることです。成体動物は直径が大きく、色素沈着が進んでいるため、より深いZ平面でのイメージングに問題が生じます。

さらに、カバースリップの導入部も初期向きを変更します。このチャネルは、カバースリップ導入時に動物の向きを維持するのに役立ち、標的細胞をイメージングの目的に近づけることができます。また、このチャンネルは、正常な生理機能を促進し、直線的な動物配置を促進し、複数の動物間でイメージングする際に一貫性を生み出す動物へのストレスを軽減します。

まず、1〜10の比率の速硬化剤をベースに使い捨ての計量皿に注ぎます。未硬化の液体が完全に統合され、泡でいっぱいになるまで、45秒間完全に混合します。次に、未硬化のPDMS混合物が入ったトレイを真空デシケーターに傾けて置きます。

マイナス0.09キロパスカルからマイナス0.1キロパスカルまでの圧力を3回循環させて、気泡が浮かび上がるようにします。ビニールレコードとガラスプレートを脱イオン水で十分にすすぎ、ビニールレコードを完全に風乾させてから使用してください。ホットプレートの上にアルミホイルのシートを置き、余分なPDMSをキャッチします。

次に、ビニールレコードの両端にスライドガラスを配置して型の厚さを設定し、未硬化のPDMSにガラス板を押し付けるときに均一な高さを確保します。次に、未硬化のPDMS液をビニールレコードの片面に注ぎます。ガラス板を傾けてゆっくりと下ろし、閉じ込められた空気を逃がします。

その後、PDMSを摂氏100度で20分間硬化させます。ビニールレコードをホットプレートから取り出し、冷まします。その後、破れないようにビニールレコードからPDMSを慎重に剥がします。

次に、PDMSをガラス板から剥がします。新しいスライドガラスをガイドとして使用して、鋭利なカミソリでPDMSを切断し、チャネル状の寒天型を作成します。余分なPDMSをはがして、最終カットのチャネル型寒天型を示します。

0.6グラムの寒天と30ミリリットルの線虫成長培地液体ストックをフラスコに加えます。攪拌棒をフラスコに入れ、120°Cに設定したホットプレートで混合物を加熱します。ゲルが溶けた後、120マイクロリットルのアジ化ナトリウムストック溶液を追加します。

次に、PDMSの型を水で十分に洗い、自然乾燥させます。PDMSモールドを2組のスライドペアの間に置き、使用の準備をします。ピペットを使用して、寒天溶液を上下に引き出してピペットチップを温め、300マイクロリットルの溶融寒天をPDMS型にピペットで移動します。

最後に、顕微鏡スライドを寒天に直接置き、側面のスライドに載せるようにします。寒天が完全に冷めたらスライドを取り外します。チャネリング寒天パッドは、動物を転がして外陰部やS字腸などのランドマークを整列させることにより、線虫の正確な向き付けを容易にし、蛍光解剖顕微鏡で検証してから倒立顕微鏡に移しました。

蛍光イメージングにより、蛍光顕微鏡写真に示されているように、チャネル化された寒天パッド上の線虫Caenorhabditis elegansの適切な配向が確認されました。チャネリング寒天パッドは、再生されたニューロンファイバーを対物レンズの近くに配置することで、ニューロン再生のイメージング品質を向上させ、光の散乱と吸収を最小限に抑えます。