המיקוד העיקרי של המעבדה שלנו הוא הגדרת המנגנונים העומדים בבסיס התחדשות מערכת העצבים המרכזית של יונקים באמצעות אורגניזם המודל, C.elegans. אנו חוקרים התחדשות על פני נוירונים מרובים ומחפשים את זהות אות ההתניה המוקדמת שמוביל להתחדשות משופרת של מערכת העצבים המרכזית. אתגרי הניסוי הנוכחיים כוללים הכנסת בועות אוויר תוך החלפת לוח הזכוכית על תקליט הוויניל וקבלת עובי תבנית אחיד.
עם זאת, לאחר יצירת תבנית ה-PDMS, ניתן לעשות בה שימוש חוזר ללסתות. הפער המחקרי שאנו מטפלים בו הוא שליטה מוגבלת על האוריינטציה של בעלי חיים בוגרים. בעלי חיים בוגרים הם בעלי קוטר גדול יותר והם פיגמנטיים יותר וגורמים לבעיות הדמיה במישורי Z עמוקים יותר.
בנוסף, מבוא פתק הכיסוי משנה גם את הכיוון הראשוני. התעלות עוזרות לשמור על הכיוון של בעלי חיים עם החדרת החלקת הכיסוי, ומאפשרות לתאי המטרה להיות קרובים יותר למטרה להדמיה. הערוצים גם מפחיתים את הלחץ על בעלי חיים, מקדמים פיזיולוגיה תקינה, מעודדים תצורה ליניארית של בעלי חיים ויוצרים עקביות בעת הדמיה על פני מספר בעלי חיים.
כדי להתחיל, שפכו יחס אחד עד 10 של חומר הריפוי המהיר לבסיס לכלי שקילה חד פעמי. מערבבים היטב את הנוזל הלא נרפא במשך 45 שניות עד שהוא נטמע במלואו ומלא בבועות. לאחר מכן הנח את המגש המכיל את תערובת ה-PDMS הלא נרפאה במייבש ואקום בהטיה.
מחזורי את הלחץ בין מינוס 0.09 קילו פסקל למינוס 0.1 קילו פסקל שלוש פעמים כדי לאפשר לבועות אוויר לעלות על פני השטח. שטפו היטב את תקליט הוויניל וצלחת הזכוכית במים נטולי יונים, ותנו לתקליט הוויניל להתייבש לחלוטין לפני שימוש נוסף. הניחו יריעת נייר אלומיניום על גבי הפלטה החמה כדי לתפוס עודפי PDMS.
לאחר מכן הנח שקופית זכוכית בכל קצה של תקליט הוויניל כדי להגדיר את עובי התבנית, תוך הבטחת גובה אחיד בעת לחיצה על חלונית הזכוכית על ה-PDMS הלא נרפא. כעת, שפכו את נוזל ה-PDMS הלא נרפא על צד אחד של תקליט הוויניל. הטה את לוחית הזכוכית והורד אותה לאט כדי לאפשר לאוויר כלוא לברוח.
לאחר מכן רפאו את ה-PDMS ב-100 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הסר את תקליט הוויניל מהפלטה החמה ואפשר לו להתקרר. לאחר מכן, קלף בזהירות PDMS מתקליט הוויניל כדי למנוע קריעה.
לאחר מכן קלף את ה-PDMS מזכוכית הזכוכית. בעזרת מגלשת זכוכית חדשה כמדריך, חותכים את ה-PDMS בעזרת סכין גילוח חד ליצירת תבנית אגר מתועלת. קלף את עודפי ה-PDMS כדי להציג את תבנית האגר המתועלת החתוכה הסופית.
הוסף 0.6 גרם אגר ו -30 מיליליטר מלאי נוזלי בינוני לגידול נמטודות לבקבוק. מניחים מוט ערבוב לתוך הבקבוק ומחממים את התערובת על פלטה חמה, מכוונת ל -120 מעלות צלזיוס. הוסף 120 מיקרוליטר של תמיסת מלאי נתרן אזיד לאחר שהג'ל נמס.
לאחר מכן שטפו היטב את תבנית ה-PDMS במים ותנו לה להתייבש באוויר. הנח את תבנית ה-PDMS בין שני סטים של זוגות שקופיות כדי להתכונן לשימוש. בעזרת פיפטה, משוך את תמיסת האגר למעלה ולמטה כדי לחמם את קצה הפיפטה ופיפטה 300 מיקרוליטר אגר מומס על תבנית ה-PDMS.
לבסוף, הנח שקופית מיקרוסקופ ישירות על האגר, וודא שהוא מונח על המגלשות בצדדים. הסר את השקופית לאחר שהאגר התקרר לחלוטין. רפידות אגר מתועלות הקלו על ההתמצאות המדויקת של Caenorhabditis elegans על ידי גלגול החיה כדי ליישר ציוני דרך, כגון הפות והמעי בצורת S, שאומתו במיקרוסקופ פלואורסצנטי לפני העברתם למיקרוסקופ הפוך.
הדמיה פלואורסצנטית אימתה את הכיוון הנכון של Caenorhabditis elegans על רפידות האגר המתועלות כפי שמוצג במיקרוגרפים פלואורסצנטיים. רפידות אגר מתועלות שיפרו את איכות ההדמיה להתחדשות עצבית על ידי מיקום סיבי נוירונים מחודשים קרוב יותר לעדשת האובייקט, תוך מזעור פיזור וספיגת האור.
