بالنسبة للمرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بأورام صلبة في الثدي أو البنكرياس ، هناك علاقة قوية بين أحداث تطور المرض ، مثل ورم خبيث أو مقاومة العلاج ، والنتائج السيئة. من المعروف أن الآليات الجزيئية الخلوية التي تحكم توازن الأنسجة والتليف تتحكم أيضا في تطور الورم الصلب. يهتم مختبري بفهم هذه الآليات حتى نتمكن من تطوير العلاجات والتدابير التشخيصية بشكل أفضل لمساعدة المرضى.
يتمثل أحد التحديات التجريبية الرئيسية في أن هناك حاجة ماسة لنماذج السرطان ثلاثية الأبعاد التي يمكنها التقاط التفاعلات بين الخلايا أثناء العمليات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية ، وبعد ذلك من خلال فهم هذه التفاعلات ، يمكن فهم رؤى إضافية حول الأمراض لتطوير استراتيجيات علاج جديدة. سيوفر بروتوكولنا طريقة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكرار تكرر ميزات البيئة المجهرية للأنسجة في الجسم الحي. سيوفر بروتوكولنا طرقا سهلة وسريعة لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد خالية من السقالات وقائمة على السقالات يمكننا من خلالها تحديد التفاعلات الخلوية غير المتجانسة.
لقد اكتشفنا طريقة لصياغة الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد بكفاءة والتي يمكن استخدامها مع النماذج الخالية من السقالات ، ولكن يمكن أيضا دمجها مع الأنظمة القائمة على السقالات لقياس غزو الخلايا وسلوكها. للبدء ، قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية لتعقيم الجزء الداخلي من خزانة السلامة الحيوية لمدة 15 دقيقة. افتح وشاح نافذة خزانة السلامة الحيوية لتثبيت تدفق الهواء وتشغيل نظام الشفط بالفراغ.
قم بتنظيف سطح غطاء المحرك الداخلي وأنبوب نظام الشفط الفراغي بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بتسخين وسط زراعة الخلايا ، PBS ، و 0.25٪ تريبسين EDTA إلى 37 درجة مئوية في حمام الخرز. الآن ، افحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من التقاء 70 إلى 80٪.
باستخدام شفاط فراغ ، قم بشفط وسيط الثقافة والتخلص منه من الخلايا المطلية. اغسل الوسط المتبقي مرة واحدة بملليلترين من PBS ، ثم استنشق وتخلص من PBS بعد الغسيل. بعد ذلك، باستخدام ماصة دقيقة، أضف ملليلترا واحدا من التربسين إلى طبق زراعة الخلايا وضع الصفيحة داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
الآن ، أضف ملليلترا واحدا من مثبط التربسين لفول الصويا في PBS إلى اللوحة لتعطيل التربسين. لتفريق مجموعات الخلايا ، قم بماصة الخليط السائل باستخدام ماصة دقيقة P-1000. اجمع تعليق الخلية من أسفل اللوحة وانقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 100 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية باستخدام شفاط الفراغ. دع مجسات الفلورسنت الجزيئية دافئة إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في حمام حبة خفف عند 37 درجة مئوية. باستخدام ماصة دقيقة ، أعد تعليق الخلايا في ملليلترين من محاليل وسائط صبغ تعقب الخلايا العاملة المعنية.
احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 100 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، استخدم شفاط فراغ لشفط المادة الطافية والتخلص منها.
أعد تعليق الحبيبات جيدا في مليلتر واحد من DMEM المحتوي على FBS بنسبة 10٪ باستخدام ماصة دقيقة. الآن ، اجمع 10 ميكرولترات من تعليق الخلية وانقلها إلى أنبوب دقيق يحتوي على حجم متساو من التربان الأزرق. بعد خلط الخلايا ، أضف 20 ميكرولترا من محلول الtrypan الخلوي إلى شريحة غرفة عد الخلايا.
أدخل الشريحة في عداد خلية تلقائي لتحديد رقم الخلية. احسب متوسط إجمالي عدد الخلية الحية من قراءتين. قم بإعداد مخزونات الخلايا العاملة لكل نوع من الخلايا بتركيز 6.67 في 10 إلى قوة ثلاث خلايا لكل مليلتر ، أي ما يعادل 2,000 خلية لكل 300 ميكرولتر.
باستخدام ماصة دقيقة، انقل الحجم المطلوب لثلاث مكررات تقنية بالإضافة إلى مكرر إضافي واحد في أنبوب دقيق. بعد الخلط جيدا باستخدام ماصة ، انقل 300 ميكرولتر من العينة إلى بئر من صفيحة دقيقة منخفضة للغاية على شكل حرف U 96 بئر. ضع الطبق المكون من 96 بئرا في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية.
صورة نمو كروي ومورفولوجيا كل 24 ساعة ، حتى 96 ساعة ، باستخدام مجهر تباين الطور. قم بتشغيل أجهزة التصوير والحاضنة الآلية. قم بإنشاء بروتوكول تصوير جديد في مدير مهام برنامج التصوير لالتقاط نمو 48 ساعة من الكرويات BT-474 المستزرعة بشكل مشترك مع الخلايا الليفية BJ-5ta والخلايا البطانية EA.hy926 الملطخة بأصباغ تعقب الخلايا باللون الأزرق والبرتقالي والأحمر الغامق على التوالي.
املأ دلو ثلج بالثلج للحفاظ على محلول استخراج الغشاء القاعدي باردا وضع المحلول على الثلج. باستخدام ماصة متعددة القنوات، استنشق ما يقرب من 170 ميكرولتر من الوسط من طبق الاستزراع. احصل على عدسة مكبرة وصندوق إضاءة صغير لمراقبة الكرويات الصغيرة عن كثب.
ضع اللوحة الكروية المكونة من 96 بئرا فوق صندوق الضوء وضع العدسة المكبرة في الأعلى. اضبط ماصة P-200 على 30 ميكرولتر واجمع مستخلص الغشاء القاعدي لإنشاء ثلاث قطرات دقيقة. تأكد من أن الصفيحة التي تحتوي على 96 بئرا مسطحة وضع الماصة عموديا فوق الكروية.
الآن ، حرر القطرة دون لمس قاع البئر. ضع الطبق في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بتراكب الكرات ب 50 ميكرولترا إضافيا من محلول استخراج الغشاء القاعدي لكل بئر واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ثم ، باستخدام ماصة دقيقة ، أضف 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا إلى كل بئر. بعد 72 ساعة من الطلاء ، أظهرت خلايا MCF-10A و MCF-10Ca1H و BT-474 المستزرعة بشكل مشترك مع EA.hy926 و THP-1 أو مع BJ5-ta و THP-1 زيادة كبيرة في المساحة الكروية مقارنة بالأشكال الكروية أحادية الزرعة. في المقابل ، أظهرت خلايا MDA-MB-468 المستزرعة بشكل مشترك انخفاضا كبيرا في المساحة الكروية مقارنة بالزراعة الأحادية.
أظهر تطبيق صبغة تعقب الخلايا على الخلايا الظهارية السرطانية BT-474 والخلايا اللحمية قبل إنشاء اللحمة أن الخلايا اللحمية ، بما في ذلك EA.hy926 و BJ-5ta ، شكلت الهياكل الناشئة في محيط الكرويات المركزية BT-474. بعد 24 ساعة من الطلاء ، تم تراكب غشاء القاعدي على الخلايا الظهارية السرطانية BT-474 المزروعة بالاشتراك مع الخلايا اللحمية ، مما يدل على تكوين هياكل غازية.
