Name: studying tgf-β signaling and tgf-β-induced epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer and normal cells
Uploaded: 2020-10-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying TGF-Î² Signaling and TGF-Î²-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells at JoVE.com

ونعترف بدعم مجلس المنح الدراسية الصيني (CSC) إلى J.Z. ومركز جينوميكس السرطان في هولندا (CGC). NL) إلى P.t.D.

1. تحليل من TGF-β الناجمة SMAD2 الفوسفور باستخدام النشاف الغربية
ملاحظة: تم استخدام خلايا MCF10A-رأس الثدي الإنسان premalignant كمثال للتحقيق في الاستجابات إشارة TGF-β33. من حيث المبدأ، الطرق الموضحة أدناه تنطبق أيضاً على خطوط الخلايا الأخرى TGF-β المستجيبة.
<ol><li>ثقافة الثدي خط الخلية الظهارية MCF10A-راس في 37 درجة مئوية في متوسطة النسر (DMEM) /F12 Dulbecco تعديل تحتوي على L-الجلوتامين مع 5٪ مصل الحصان، 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF), 10 ملغ / مل الأنسولين, 100 نانوغرام / مل الكوليرا enterotoxin, 0.5 ملغم / مل هيدروكورتيزون, و 1:100 البنسلين-الستربتوميسين (القلم-ستريب).</li>
	<li>حاول أن تُستخدم خلايا MCF10A-رأس مع 1 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA لمدة دقيقة واحدة و حساب الخلايا القابلة للحياة باستخدام عداد خلية.</li>
	<li>بذور الخلايا في 6-صحن في كثافة 5×105 الخلايا/جيدا.</li>
	<li>بعد نمو بين عشية وضحاها، علاج الخلايا مع إما TGF-β (5 نانوغرام /مل) أو العازلة ليغاند (4 mM HCl، 0.1٪ الدهنية حمض خالية من الزمن الألبومين المصل (BSA)) لمدة 1 ساعة، ومن ثم إزالة ثقافة المتوسطة وغسل بلطف الخلايا مرتين مع 1 مل من الفوسفات المخزنة المالحة (PBS).</li>
	<li>خلايا باردة في 6-آبار لوحات على الجليد وإضافة 150 ميكرولتر من قبل التبريد اختبار مناعية ترسيب (RIPA) العازلة تحلل (150 mM NaCl، 0.1٪ تريتون X-100، 0.5٪ ديوكسيتشولات الصوديوم، 0.1٪ SDS، 50 mM تريس-HCl pH 8.0، وأضاف حديثا مصغرة مثبطات البروتين كوكتيل). السماح للتحلل للمضي قدما على الجليد لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>كشط الخلايا الملتصية قبالة الطبق باستخدام مكشطة الخلايا البلاستيكية، ثم نقل بلطف تعليق الخلية إلى أنبوب microcentrifuge المبردة مسبقا.</li>
	<li>الطرد المركزي الخلية lysate لمدة 10 دقيقة في قوة الطرد المركزي 150 (ز )في 4 درجة مئوية ونقل سوبرنات إلى أنبوب جديد 1.5 مل microcentrifuge.</li>
	<li>قياس تركيز البروتين باستخدام المنظفات متوافقة (DC) مجموعة من البروتين فحص.</li>
	<li>تحميل 30 ميكروغرام من البروتين من كل عينة على 10٪ الصوديوم دوديسيل كبريتات هلام 1.5-2 ساعات.</li>
	<li>نقل البروتينات من هلام إلى 45-μm بولي فينيلايدين difluoride (PVDF) غشاء في الجهد من 110 V لمدة 1-1.5 ساعة.</li>
	<li>نقل غشاء PVDF في وعاء مناسب مع الجانب البروتين (الجانب الذي كان يواجه الجل) حتى، وشطف لفترة وجيزة الغشاء في الماء المقطر.</li>
	<li>تجاهل الماء، إضافة بونساو S الحل، ووضع الغشاء على منصة هزاز لمدة 1-2 دقيقة.</li>
	<li>إزالة وصمة عار الغشاء مع الماء المقطر عن طريق الشطف بسرعة ومن ثم غسله لمدة 1 دقيقة.</li>
	<li>ثم، وضع غشاء PVDF على مربع الضوء، واتخاذ صورة للتحقق من الأحمال البروتين الكلي على قدم المساواة.</li>
	<li>اغسل الغشاء مع محلول ملحي ثلاثية التخزين مع Tween 20 (TBST، 20 mM تريس-HCl، 7.4، 150 mM NaCl، و 0.1٪ توين 20) حتى لا يكون هناك تلطيخ مرئي.</li>
	<li>وضع الغشاء في عازلة منع (5٪ الحليب المقشود في حل TBST) واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>غسل الغشاء مرتين مع TBST.</li>
	<li>احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية ضد فوسفو-SMAD2 (ف-SMAD2; 1:1000, منزلي الصنع 34),مجموع SMAD2/3 1:1000 وغليسيرالدهيد 3-فوسفات ديهيدروجيناز (GAPDH; 1:1000), بين عشية وضحاها في 4 °C.</li>
	<li>غسل الغشاء مرتين مع TBST واحتضان الغشاء مع جسم مضاد الثانوية ضد أرنب أو فأر (1:5000) لمدة 2 ساعة.</li>
	<li>احتضان غشاء PVDF مع الركيزة ECL الغربية لمدة 30 ثانية، والكشف عن إشارة باستخدام نظام التصوير.</li>
	<li>كرر التجارب ثلاث مرات على الأقل للحصول على ثلاث مرات بيولوجية.</li>
</ol>2. تحليل الاستجابات النسخية التي تعتمد على SMAD3 التي β TGF
<ol><li>تنفيذ SMAD3/SMAD4 التابعة CAGA12-luciferase مقايسة مراسل النسخ.<ol>
<li>الثقافة و trypsinize MCF10A-رأس الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1. خلايا البذور في لوحات 24-جيدا في 5×104 خلايا / جيدا والسماح للخلايا للتمسك بين عشية وضحاها.</li>
		<li>في اليوم التالي البذر، cotransfect الخلايا في كل بئر مع 100 نانوغرام من TGF-β/SMAD3-inducible (CAGA)12 لوسيفيراز النسخي بناءمراسل 35 و 80 نانوغرام من β-galactosidase بناء التعبير باستخدام polyethylenimine (PEI). يتم استخدام نقل β-galactosidase لتطبيع الاختلافات في كفاءة نقل بين الآبار المختلفة. إعداد كل مجموعة تجريبية في ثلاث ية.</li>
		<li>بعد 24 ساعة من الحضانة, تجويع الخلايا مع الدم خالية DMEM-high الجلوكوز, 6 ساعات في وقت لاحق, إضافة TGF-β (5 نانوغرام / مل) أو العازلة ليغاند (4 M HCl, 0.1٪ BSA) كتحكم في السيارة إلى الخلايا.</li>
		<li>بعد 24 ساعة أخرى من الحضانة ، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني مُثلج الدفء.</li>
		<li>أضف 120 ميكرولتر/بئر 1× عازلة للتحلل واهز الطبق برفق عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.</li>
		<li>نقل 30 ميكرولتر من lysate إلى كل بئر من 96 جيدا بيضاء المقايسة الصغيرة لقياس نشاط لوسيفراز باستخدام مضيئة.</li>
		<li>نقل 50 ميكرولتر من lysate إلى كل بئر من لوحة شفافة 96 جيدا لقياس β-galactosidase النشاط.</li>
		<li>تطبيع النشاط luciferase إلى النشاط β galactosidase وتكرار التجارب ثلاث مرات على الأقل للحصول على ثلاث مرات البيولوجية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحليل التعبير عن الجينات الهدف TGF-β باستخدام كمية في الوقت الحقيقي البوليميراز سلسلة التفاعل (qRT-PCR).<ol>
<li>الثقافة و trypsinize MCF10A-رأس الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1. خلايا البذور في لوحات 6-جيدا في 5×105 خلايا / جيدا والسماح للخلايا الالتزام بين عشية وضحاها.</li>
		<li>علاج الخلايا مع TGF-β (5 نانوغرام / مل) أو العازلة ليغاند (4 mM HCl، 0.1٪ BSA) لمدة 6 ساعات، ثم غسل الخلايا مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.</li>
		<li>عزل إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام عدة عزل RNA.</li>
		<li>تحديد تركيز الحمض النووي الريبي مع NanoDrop وتنفيذ التوليف cDNA مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي باستخدام أول خيطاً cDNA التوليف كيت.</li>
		<li>استخدام نظام الكشف في الوقت الحقيقي PCR لتنفيذ الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qRT-PCR) مع عشرة أضعاف cDNA المخفف في خليط تفاعل 10 ميكرولتر التي تشمل محددة الإنسان إلى الأمام والأقراص التمهيدية العكسي لDEDH (للتطبيع)، SERPINE1 (ترميز بروتين PAI-1، الجين المستهدف TGF-β/SMAD)و SMAD7 (الجين المستهدف TGF-β/SMAD) و QPCR Master Mix. إعداد كل مجموعة تجريبية في ثلاث ية. ملاحظة: التسلسلات التمهيدية المستخدمة للكشف عن الجينات البشرية المستهدفة في qRT-PCR مدرجة في الجدول 1.</li>
		<li>استخدام حالات رد فعل qPCR التالية: التهيئة, 95 ° C لمدة 3 دقائق; denaturation، 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان؛ التشبث، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ والامتداد، 80 درجة مئوية لمدة 10 ثوان؛ يتم تكرار التكفير والحنيع والامتداد 40 مرة.</li>
		<li>كرر التجارب ثلاث مرات على الأقل للحصول على ثلاث مرات بيولوجية.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. تحليل EMT الناجم عن β TGF
<ol><li>تحليل التعبير عن علامات EMT على مستوى البروتين باستخدام النشاف الغربية. ملاحظة: يتم عرض تحليل EMT الناجم عن β TGF باستخدام الخلايا الظهارية NMuMG ماوس كمثال36،37.<ol>
<li>ثقافة NMuMG الخلايا في 37 درجة مئوية في DMEM عالية الجلوكوز المتوسطة تكملها 10٪ مصل الأبقار الجنين و 1:100 القلم-ستريب. استخدام الطرق الموضحة في الخطوة 1 لعزل البروتين واكتشافه. ملاحظة: الأجسام المضادة التالية تستخدم في هذه التجربة: E-cadherin, 1:1000; N-cadherin, 1:1000; الحلزون، 1:1000؛ سبيكة، 1:1000؛ توبولين، 1:1000 (الشكل 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحليل التعبير عن علامات EMT على مستوى مرنا باستخدام كمية في الوقت الحقيقي PCR كما هو موضح في الخطوة 2.2. ملاحظة: جميع الفارات الماوس المستخدمة لqRT-PCR، بما في ذلك CDH1 (ترميز البروتين E-cadherin)، الحلزون، وZEB2 (الشكل 3)مدرجة في الجدول 1.</li>
	<li>تحليل عملية EMT باستخدام الفلوروسينة المناعية غير المباشرة وتلطيخ الفلوروسين المباشر.<ol>
<li>صبغ الفلوروس المناعي غير المباشر لـ E-cadherin<ol>
<li>مكان معقمة 18 مم الجانب الزجاج المربع يغطي في لوحات 6-جيدا (واحد coverslip لكل بئر).</li>
			<li>البذور 1×105 NMuMG الخلايا مع 2 مل من DMEM كاملة لكل لوحة 6-جيدا والسماح للخلايا للتمسك بين عشية وضحاها.</li>
			<li>نقل بلطف الأغطية مع الخلايا المضمّنة إلى لوحة جديدة 6-جيدا وإضافة 2 مل من الثقافة المتوسطة إلى الآبار.</li>
			<li>علاج الخلايا مع TGF-β (5 نانوغرام / مل) أو العازلة ligand (4 M HCl، 0.1٪ BSA) لمدة 2 أيام.</li>
			<li>إزالة المتوسطة الثقافة وغسل بلطف الخلايا مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني مسبق.</li>
			<li>إصلاح الخلايا بإضافة 1 مل من 4٪ شبهformaldehyde والتحضين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، غسل بلطف الخلايا مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.</li>
			<li>Permeabilize الخلايا الثابتة مع 0.1٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.</li>
			<li>منع الخلايا مع 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.</li>
			<li>إضافة الأجسام المضادة الأولية ضد e-cadherin (المخفف 1:1000 في برنامج تلفزيوني) إلى أعلى كل غطاء واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.</li>
			<li>إزالة الأجسام المضادة الأساسية وغسل الغطاء مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.</li>
			<li>أضف الأجسام المضادة الفلورة 555 الثانوية (المخففة 1:500 في برنامج تلفزيوني) إلى أعلى كل غطاء واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع تغطية مع رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء.</li>
			<li>إزالة الأجسام المضادة الثانوية وغسل الغطاء مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.</li>
			<li>جبل الغطاء (الخلايا التي تواجهها إلى أسفل) على الشرائح الزجاجية باستخدام تصاعد المتوسطة مع 4′، 6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI) وتخزين الشرائح التي شنت في مربع في 4 °C، محمية من الضوء.</li>
			<li>مراقبة تلطيخ مع SP8 المجهرية confocal.</li>
		</ol>
</li>
		<li>تلطّخ الفلوري المباشر من خيوط (F)-actin.<ol>
<li>إعداد العينات التالية الخطوات 3.3.1.1. إلى 3.3.1.9.</li>
			<li>وصمة عار الخلايا بإضافة اليكسا فلور 488 Phalloidin (1:1000) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لتصور actin خيوط (F-actin).</li>
			<li>غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.</li>
			<li>قم بتركيب الغطاء على الشرائح الزجاجية باستخدام متوسط التركيب مع DAPI وخذ الصور باستخدام المجهر السفلي SP8.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

TGF-β/ SMAD الإشارات يلعب دورا محوريا في تطور سرطان الثدي, كما أنه يمكن تعزيز سرطان الثدي الخلايا الغازية و الانبثاث عن طريق تحفيز EMT7. هنا، وصفنا سير العمل المنطقي للتحقيق في الإشارات التي بدأتها TGF-β من تنشيط SMAD الناجم عن المستقبلات إلى الاستجابات النسخية والبيولوجية بوساطة SMAD. بدأنا من خلال وصف تحليل الفوسفور SMAD2، واصلت مع استجابات النسخ SMAD3 التي تسببها TGF-β والتعبير علامة EMT على حد سواء الجينات ومستويات البروتين لتحليل استجابة إشارة TGF-β/SMAD، وأخيرا فحصت EMT الناجمة عن β TGF. استخدمنا مراسل CAGA12-luciferase النسخ التي تحتوي على صناديق CAGA المستمدة من منظم PAI-1، لرصد نشاط TGF-β/SMAD إشارة مسار35. يتطلب إنشاء المراسل SMAD3 و SMAD4 للتنشيط. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن الضربة القاضية من SMAD4 في تخفيف TGF-β الناجمة عن CAGA12-luciferase النشاط37. بالإضافة إلى مقايسة المراسل، فإن تحديد حالة الفسفور من SMADs الذاتية، بما في ذلك SMAD2 و SMAD3، هو طريقة أخرى للتحقيق في استجابة الإشارات β TGF. في الواقع، وأعضاء آخرين من عائلة TGF-β، مثل عامل النمو والتمايز (GDF)-8/myostatin وGDF-9، أيضا إشارات transduce عبر SMAD2/3 البروتينات عن طريق إشراك TβRI42،43،44. بالإضافة إلى مراسل CAGA12-luciferase ، تم استخدام العديد من المراسلين المماثلين للكشف عن تفعيل إشارات TGF-β. على سبيل المثال، يمكن أن يكون النسخ (SBE)4-Lux مراسل مع عناصر الاستجابة المستمدة من المروج JunB مستحثة بكفاءة من قبل TGF-β، activins وBMPs45.
وقد استخدمت النشاف الغربي وqPCR لتحليل EMT التي تسببها TGF-β، والتي هي أساليب كلاسيكية للتحقيق في التعبير عن علامات الظهارة (أي، E-cadherin) وعلامات mesenchymal (أي، N-cadherin، الحلزون، سبيكة وZeb2). كما قمنا بأداء لطخة المناعة غير المباشرة من e-cadherin وتلطيخ الفلوري المباشر من F-actin. هذه المقايسات التحقق من صحة النموذج الظاهري mesenchymal من الخلايا بعد العلاج TGF-β. إن الحد من تلطّخ الفلورات المناعية هو أن الخلايا تحتاج إلى إصلاح قبل الحضانة بالأجسام المضادة والتصوير، ومن الصعب التحقيق في التغيرات في تعبير علامة EMT في الخلايا الحية. في الآونة الأخيرة، تصميم خطوط الخلايا مراسل EMT، مثل A549 الرئة غديcarcinoma-vimentin-RFP، جعلت من الممكن رصد التحول من الخلايا الظهارية إلى خلايا mesenchymal في الوقت الحقيقي عن طريق التعبير عن البروتين الفلوري الأحمر (RFP) الموسومة فيمينتين. ويمكن استخدام هذه المنصة لفحص المخدرات وتطوير المخدرات الجديدة46. LifeAct صبغ, 17-الأمينية-حمض الببتيد, التي يمكن وصمة عار F-actin الهياكل في الخلايا الحية, أصبحت أداة قيمة لتصور cytoskeleton actin في الوقت الحقيقي دون التدخل في العمليات الخلوية47. في هذه الدراسة، استخدمنا اثنين من مثبطات جزيء صغير، SB431542 وWW788388، للتحقق من تأثيرها المثبط على إشارات TGF-β وEMT الناجمة عن β TGF. وتجدر الإشارة إلى أن GW788388 يمنع بقوة نشاط TβRI و TβRII، في حين أن SB431542 له تأثير مثبط على TβRI فقط (و ALK4 و ALK7). كشفت الدراسات السابقة أن GW788388 هو أكثر قوة في الجسم الحي من SB43154240. بالإضافة إلى تثبيط EMT ، GW788388 خفض التعبير عن علامات التليف في الكلى ، والإدارة عن طريق الفم من GW788388 في الفئران السكري انخفض بشكل ملحوظ glomerulopathy25،48.
EMT يلعب دورا أساسيا في تعزيز لدونية الخلايا السرطانية والنتائج في مقاومة المخدرات و الانبثاث 49. ولذلك، استهداف الخلايا المشتقة من EMT مع أدوية سمية للخلايا محددة50 أو تحفيز إعادة التمايز عن طريق انتقال الظهارية mesenchymal إلى الظهارية (MET)51 وقد اقترح كمقاربة للتغلب على الانبثاث الخلايا السرطانية ومقاومة العلاج. ومع ذلك، MET يساهم في انتشار الخلايا السرطانية المنشورة في الأجهزة البعيدة52، والتي قد تكون ذات نتائج عكسية عند استخدام الارتداد العلاجي ل EMT. في الآونة الأخيرة، أفادت دراسة جديدة نهج التفاضلية العلاجية من خلال استهداف الخلايا السرطانية الثدي المستمدة EMT مباشرة للتمايز إلى الخلايا الشحمية30. الدراسة التي أجراها إيشاي رونين وآخرون. al.30 تستخدم Py2T مورين الخلايا السرطانية الظهارية التي خضعت للانتقال إلى الخلايا المتوسطة استجابة للعلاج على المدى الطويل مع TGF-β. وقد أثبتوا أن rosiglitazone في تركيبة مع مثبطات MEK تعزيز التمايز الظهارية وdipdipogenesis. ومع ذلك، وجدنا أن rosiglitazone وحده كان كافيا للحث على الانتقال من خلايا الميرين الليسينشيمال Py2T إلى adipocytes.
وباختصار، فإن الأساليب المستخدمة في هذه الدراسة وفرت سير عمل منطقي للتحقيق في إشارات β TGF و EMT الناجمة عن β. يمكن للمثبطين ، SB431542 و GW788388 ، منع الاستجابات الناجمة عن TGF -β و EMT. بالإضافة إلى ذلك، أظهرنا أيضًا أن rosiglitazone وحدها تحفز تكوين الخلايا الدهنية في خلايا سرطان الثدي β الميسنشية التي تسببها TGF. على الرغم من أننا استخدمنا فقط عدة خطوط خلايا سرطان الثدي للتحقيق في الاستجابات TGF-β، يمكن استقراء الطرق الموصوفة هنا إلى خلايا (سرطان) أخرى. هنا، استخدمنا تركيزات TGF-β مختلفة للحث على الاستجابات الخلوية. في معظم أنواع الخلايا، TGF-β يمارس نشاطه البيولوجي في نطاق تركيز 0.01-10 نانوغرام/مل53 ويحفز الإشارات في نمط استجابة الجرعة. في الخلايا البطانية الأولية، بما في ذلك الخلايا البطانية الأبهري البقرية، تسبب TGF-β في التعبير الكبير من SMAD2 الفوسفوري عند 0.025 نانوغرام/مل، وصلت إلى حد أقصى عند 0.25 نانوغرام/مل، وظلت عند هذا المستوى استجابة لتركيزات أعلى53. في دراستنا، استخدمنا تركيز عال من TGF-β (5 نانوغرام/مل) في خلايا MCF10A-رأس لأقوال المراسل النسخي للحصول على ردود قوية. يمكن أن يكون السبب في ذلك الفسفور SMAD2 والتعبير الجيني الهدف بواسطة TGF-β بجرعة منخفضة; وهكذا، استخدمنا 2.5 نانوغرام/مل TGF-β لعلاج الخلايا. ومع ذلك، فإن التركيز الأكثر ملاءمة العمل يعتمد على نوع الخلية والآثار المقدرة. لتحديد أفضل تركيز من TGF-β, ينصح علاج الخلايا بجرعات مختلفة (من منخفضة إلى عالية).

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.
NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-&#946; in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.

Erratum: Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

السيتوكين تحويل عامل النمو β (TGF-β) هو النموذج الأولي لمجموعة كبيرة من هيكليا ووظيفيا ذات الصلة polypeptides التنظيمية بما في ذلك TGF-βs (أي، TGF-β1، -β2 و-β3)، وبروتينات مورفوجينيك العظام (BMPs) وactivins1،2. هذه السيتوكينات تلعب جميعها أدوارا هامة في التنمية الجنينية وفي الحفاظ على الأنسجة والأعضاء3. سوء تنظيم TGF-β يمكن أن يؤدي إلى مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأمراض، بما في ذلك السرطان4،5. TGF-β يلعب معقدة, دور مزدوج في تطور السرطان: في الخلايا الظهارية العادية وpremalignant, TGF-β يتصرف كما القامع الورم عن طريق تثبيط انتشار وحفز المبرمج6,7; ومع ذلك، في مرحلة متأخرة من تطور الورم، عندما يتم حظر الاستجابات cytostatic عن طريق تنشيط أونكوجيني أو فقدان الجينات القامع الورم، TGF-β بمثابة محسن الورم من خلال تعزيز انتقال الظهارة إلى النخاع (EMT) في الخلايا السرطانية، مما يتيح غزو الخلايا السرطانية والنقائل، والعمل على الخلايا في البيئة الدقيقة الورم، وتحفيز تولد الأوعية والتهرب المناعي8،9،10.
ويفرز TGF-β كجزيء السلائف غير نشط التي تحتوي على ناضجة carboxy الطرفية TGF-β والببتيد الكمون المرتبطة (LAP)11. يمكن ربط هذا المركب الصغير ببروتين TGF-β ملزم (LTBP)12. ويمكن الافراج عن ناضجة TGF-β يمكن أن توسطت من قبل عمل proteases محددة أن ينشق LAP أو عن طريق سحب الميكانيكية من LAP في عملية تعتمد على integrin13,14. بالإضافة إلى LTBP، Glycoprotein التكرار السائدة (GARP) وأعرب عن ذلك بشدة على سطح الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) ويلعب دورا مماثلا كما LTBP في تنظيم تفعيل TGF-β15،16. يرتبط GARP مباشرة بـ TGF-β من خلال ربط ثنائي الكبريت والرابطة غير التكافؤية. يتطلب تفعيل TGF-β من مجمع GARP/TGF-β integrins17. ناضجة TGF-β يربط إلى مستقبلات TGF-β سيرين/ثريونين كيناز، أي، TGF-β النوع الأول (TβRI) و TGF-β نوع II (TβRII) مستقبلات18 لبدء الإشارة. إن ربط β TGF إلى TβRII يعزز توظيف TβRI وتشكيل مجمع غير اتيروي. في وقت لاحق، هو phosphorylated TβRI بواسطة kinase TβRII على المخلفات سيرين وهرونين في قصيرة جليكين- وsiine الغنية (GS) عزر، مما أدى إلى تفعيلها19،20. عند التنشيط، يتم تنشيط TβRI المجندين وفسفوريلات ركائزها: SMADs الخاصة بمستقبلات محددة (R-SMADs) التي تشمل SMAD2 و SMAD3(الشكل 1). R-SMADs حصة هيكل عام مماثل مع اثنين من ما يسمى مجالات جنون homology، MH1 و MH2، التي يتم فصلها من قبل منطقة رابط الغنية برولين(الشكل 2). لا يتم حفظ عزر ربط الحمض النووي ضمن المجال MH1 من SMAD3 بين SMAD2 و SMAD3، ولا يمكن ربط SMAD2 مباشرة الحمض النووي بسبب وجود اثنين من الإدراجات في مجال MH1 الخاص به (exon 3 و L1). SMAD2 وSMAD3 يمكن تفعيلها بواسطة الفوسفور من عزر SSXS في بهم C-termini(الشكل 2). الفوسفور SMAD2/3 أشكال المجمعات غير اتيرتي مع وسيط SMAD المشتركة، SMAD4، الذي يحول إلى نواة لتعديل النسخ من الجينات المستهدفة (الشكل 1)7,21. وينظم هذا المسار إشارة SMAD الكنسي بدقة ويولد استجابات محددة الخلوية والأنسجة مثل تنظيم مصير الخلية و ورم الخلايا الانبثاث والغزو22. بالإضافة إلى TGF-β-SMAD الإشارات، غير SMAD إشارات المسارات يمكن أيضا أن تكون مباشرة تنشيط المستقبلات لتنظيم الردود الخلوية المصب23.
أثناء تطور الورم، هناك حاجة إلى تنشيط مسارات TGF-β التي تعتمد على SMAD والمستقلة عن SMAD من أجل حث EMT. EMT هي عملية قابلة للعكس حيث تُزيل الخلايا السرطانية من النمط الظاهري الظهاري، والذي يرتبط بفقدان اتصالات الخلية وانخفاض قطبية apical-القاعدية، إلى نمط ظاهري ميثيني مع تعزيز الحركة والقدرة على الغزو24. يتميز EMT بزيادة التعبير عن بروتينات علامة الميزينشيمال ، بما في ذلك N-cadherin و vimentin وZeb2 و Snail11 /2 ، وما يصاحب ذلك من downregulation لعلامات الظهارية ، مثل e-cadherin و β - catenin (الشكل 3)25. ومع ذلك، الانتقال من الظهارية إلى حالة mesenchymal غالباً ما تكون غير مكتملة، والخلايا تكتسب خصائص الظهارية المختلطة وميزينشيمال (E/M). ورقة حديثة من قبل الرابطة الدولية EMT اقترح لوصف عملية الخلايا التي تمر دول متوسطة E / M فيينوتبيك كما الظهارية -mesenchymal اللدونة (EMP)26. هذه اللدونة تشير إلى EMT جزئية، حالة E/M الهجينة، حالة EMT ميتابل، سلسلة EMT وطيف EMT26. خلال EMT، الخلايا السرطانية تكتسب خصائص الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) وتصبح أكثر مقاومة للزواصات المبرمج الناجم عن مفرزة27. في حين أن EMT هي المسؤولة عن الحصول على النمط الظاهري الغازية في الخلايا السرطانية الأولية ويدفع تطور السرطان، في المقابل، وقد ثبت أن الانتقال mesenchymal-الظهارية (MET) تلعب دورا هاما في الخروج من الخلايا السرطانية نشرها في مواقع النقيلي بعيد28،29. أظهرت دراسة حديثة أن خلايا سرطان الثدي المستمدة من EMT يمكن أن تكون متمايزة إلى الخلايا الشحمية ، والتي قد توفر فرصة لمنع الانبثاث والتغلب على مقاومة العلاج في الخلايا السرطانية والسرطان الانتكاس30. نظرا للدور الهام لTGF-β الإشارات في تفعيل EMT في سرطان الثدي، نقدم بروتوكولات مفصلة لنشاف الغربية، وهو مقول النسخ luciferase مقايسة، الكمية في الوقت الحقيقي البوليميراز سلسلة التفاعل (qRT-PCR)، ومناعة منابع للتحقيق من TGF-β الإشارات، TGF-β الناجمة عن EMT، وtrans-differentiation من الخلايا الثدي الظهارية المورين المستمدة EMT إلى الخلايا الدهنية. هذه التقنيات هي الأدوات التحليلية الأكثر استخداما في مجال بيولوجيا الخلية. يتم استخدام qRT-PCR للكشف عن مستويات التعبير في الرنا وتمييزها وقياسها بطريقة كمية. بالمقارنة مع PCR الكمية (qPCR)، تقنية بديلة، النسخ العكسي (RT)-PCR يمكن استخدامها لتحديد التعبير مرنا بطريقة شبه كمية31،32. يستخدم النشاف الغربي لفحص مستويات بروتينية محددة في عينة خلية معينة مع مزايا الحساسية وخصوصية، بطريقة شبه كمية. وهكذا، نقدم سير عمل منهجي لتحليل التغيرات من التعبير الجيني إلى تعبير البروتين للمساعدة في التحقيق في إشارة TGF-β التي يمكن تطبيقها أيضًا على مسارات الإشارات الأخرى.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm-side square glass coverslips</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td>631-1331</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E-cadherin antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td></td></tr><tr><td>anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB374</td><td></td></tr><tr><td>Anti-N-cadherin antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610920</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Slug antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9585</td><td></td></tr><tr><td>anti-SMAD2/3 antibody</td><td>Becton Dickinson</td><td>610842</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Snail antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3879</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tubulin antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2148</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Cholera enterotoxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>DC protein assay kit</td><td>Bio-Rad</td><td>5000111</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-high glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-high glucose medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039047</td><td></td></tr><tr><td>epidermal growth factor (EGF)</td><td>Merck Millipore</td><td>01-107</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>BioWest</td><td>S1860-500</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>PROMEGA</td><td>A600X</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA II kit</td><td>BIOKE&amp;acute;</td><td>740955</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>557366-M</td><td></td></tr><tr><td>Skimmed milk</td><td>Campina: Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Imaging System</td><td>Bio-Rad</td><td>17001402</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Perkin Elmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr></tbody></table>

studying tgf-&#946; signaling and tgf-&#946;-induced epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer and normal cells

تحويل عامل النمو β (TGF-β) هو عامل متعدد الوظائف المفرزة التي تلعب دورا رئيسيا في الاتصالات بين الخلايا. يمكن أن تؤدي الانزعاجات من إشارات TGF-β إلى الإصابة بسرطان الثدي. TGF-β يثير آثاره على الانتشار والتمايز عبر سطح الخلية محددة TGF-β نوع I و مستقبلات النوع الثاني (أي TβRI و TβRII) التي تحتوي على مجال داخلي serine / threonine كيناز. بناء على تشكيل مجمع غير اتيروتي مستحث β TGF، يقوم TβRI المنشط بإثارة الإشارات داخل الخلايا بواسطة الفوسفور SMAD2 وSMAD3. هذه SMADs تنشيط تشكيل مجمعات غير متجانسة مع SMAD4 لتنظيم الجينات المستهدفة محددة, بما في ذلك مثبط تنشيط البلازمينوجين 1 (PAI-1, ترميز من قبل الجين SERPINE1). إن تحريض الانتقال الظهاري إلى الظهارية (EMT) يسمح للخلايا السرطانية الظهارية في الموقع الأساسي أو أثناء الاستعمار في مواقع بعيدة للحصول على نمط ظاهري غازي ودفع تطور الورم. TGF-β بمثابة محفز قوي لغزو سرطان الثدي من خلال قيادة EMT. هنا، نحن وصف أساليب منهجية للتحقيق TGF-β الإشارات والاستجابات EMT باستخدام ما قبل التهانينات البشرية MCF10A-RAS (M2) الخلايا والماوس NMuMG الظهارية الخلايا كمثال. نحن وصف أساليب لتحديد TGF-β الناجمة SMAD2 الفوسفور بواسطة النشاف الغربية، SMAD3/SMAD4-تعتمد على نشاط النسخ باستخدام نشاط المراسل luciferase والتعبير الجيني SERPINE1 الهدف بواسطة كمية في الوقت الحقيقي البوليميراز سلسلة التفاعل (qRT-PCR). بالإضافة إلى ذلك، يتم وصف أساليب لفحص EMT الناجم عن β TGF عن طريق قياس التغيرات في مورفولوجيا، تعبير علامة الظهارية والميسنشية، التلطيخ الخيوط والثبوت المناعي من الفلوروسين E-cadherin. تم استخدام اثنين من الجزيء الصغير الانتقائي TGF-β مثبطات كيناز مستقبلات, GW788388 و SB431542, لمنع TGF-β الناجمة SMAD2 الفوسفور, الجينات المستهدفة والتغيرات في التعبير علامة EMT. وعلاوة على ذلك، فإننا وصف لتمايز الثدي mesenchymal Py2T مورين الخلايا السرطانية الظهارية إلى adipocytes. قد تساهم طرق فحص الإشارات الناجمة عن β TGF وEMT في سرطان الثدي في اتباع نهج علاجية جديدة لسرطان الثدي.

Watch this Scientific Journal Video about Studying TGF-Î² Signaling and TGF-Î²-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells at JoVE.com

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

نحن وصف سير العمل المنهجي للتحقيق TGF-β إشارات وTGF-β الناجمة عن EMT من خلال دراسة التعبير البروتيني والمورثات المشاركة في هذا المسار إشارة. وتشمل هذه الطرق النشاف الغربية، ومقايسة مراسل لوسيفراز، وqPCR، وتلطيخ المناعة.

دراسة TGF-β الإشارة و TGF-β الناجمة عن الظهارية إلى mesenchymal التحول في سرطان الثدي والخلايا الطبيعية

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.7K Views.  Leiden University Medical Center. نحن وصف سير العمل المنهجي للتحقيق TGF-β إشارات وTGF-β الناجمة عن EMT من خلال دراسة التعبير البروتيني والمورثات المشاركة في هذا المسار إشارة. وتشمل هذه الطرق النشاف الغربية، ومقايسة مراسل لوسيفراز، وqPCR، وتلطيخ المناعة.

Video: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

كروي الفحص لقياس TGF - β بفعل الغزو

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Medicine

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

تطوير<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لتقييم مقلص وظيفة الخلايا الجذعية الوسيطة التي خضعت طلائي-الوسيطة الانتقالية

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Developmental Biology

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic plasticity drives invasion, dissemination and metastasis. Indeed, while most of the studies of phenotypic plasticity have been in the context of epithelial-derived carcinomas, it turns out sarcomas, which are mesenchymal in origin, also exhibit phenotypic plasticity, with a subset of sarcomas undergoing a phenomenon that resembles a mesenchymal-epithelial transition (MET). Here, we developed a method comprising the miR-200 family and grainyhead-like 2 (GRHL2) to mimic this MET-like phenomenon observed in sarcoma patient samples.We sequentially express GRHL2 and the miR-200 family using cell transduction and transfection, respectively, to better understand the molecular underpinnings of these phenotypic transitions in sarcoma cells. Sarcoma cells expressing miR-200s and GRHL2 demonstrated enhanced epithelial characteristics in cell morphology and alteration of epithelial and mesenchymal biomarkers. Future studies using these methods can be used to better understand the phenotypic consequences of MET-like processes on sarcoma cells, such as migration, invasion, metastatic propensity, and therapy resistance.

We present here a cell culture method for inducing mesenchymal-epithelial transitions (MET) in sarcoma cells based on combined ectopic expression of microRNA-200 family members and grainyhead-like 2 (GRHL2). This method is suitable for better understanding the biological impact of phenotypic plasticity on cancer aggressiveness and treatments.

تحريض الوسيطة-طلائي التحولات في خلايا الورم اللحمي

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction of differentiation of two mouse breast epithelial cell lines, HC11 and EpH4, and their use to study complementary stages of mammary gland development and neoplastic transformation.
The HC11 mouse breast epithelial cell line originated from the mammary gland of a pregnant Balb/c mouse. It differentiates when grown to confluence attached to a plastic Petri dish surface in medium containing fetal calf serum and Hydrocortisone, Insulin and Prolactin (HIP medium). Under these conditions, HC11 cells produce the milk proteins &#946;-casein and whey acidic protein (WAP), similar to lactating mammary epithelial cells, and form rudimentary mammary gland-like structures termed &#34;domes&#34;.
The EpH4 cell line was derived from spontaneously immortalized mouse mammary gland epithelial cells isolated from a pregnant Balb/c mouse. Unlike HC11, EpH4 cells can fully differentiate into spheroids (also called mammospheres) when cultured under three-dimensional (3D) growth conditions in HIP medium. Cells are trypsinized, suspended in a 20% matrix consisting of a mixture of extracellular matrix proteins produced by Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells, plated on top of a layer of concentrated matrix coating a plastic Petri dish or multiwell plate, and covered with a layer of 10% matrix-containing HIP medium. Under these conditions, EpH4 cells form hollow spheroids that exhibit apical-basal polarity, a hollow lumen, and produce &#946;-casein and WAP.
Using these techniques, our results demonstrated that the intensity of the cadherin/Rac signal is critical for the differentiation of HC11 cells. While Rac1 is necessary for differentiation and low levels of activated RacV12 increase differentiation, high RacV12 levels block differentiation while inducing neoplasia. In contrast, EpH4 cells represent an earlier stage in mammary epithelial differentiation, which is inhibited by even low levels of RacV12.

We describe techniques for differentiation induction of two breast epithelial lines, HC11 and EpH4. While both require fetal calf serum, insulin, and prolactin to produce milk proteins, EpH4 cells can fully differentiate into mammospheres in three-dimensional culture. These complementary models are useful for signal transduction studies of differentiation and neoplasia.

التمايز من الثدي الماوس HC11 وخلايا EpH4

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

والتعديل<em&gt; في المختبر</em&gt; الغزو الفحص لتحديد الدور المحتمل للالهرمونات، السيتوكينات و / أو عوامل النمو في التوسط السرطان غزو الخلايا

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and mechanical stability, and represents a core element of multi-cellular animal life. In adherent cells, acto-myosin contraction is seen in traction forces that cells exert on their substrate. Dysregulation of cellular contractility appears in a myriad of pathologies, making contractility a promising target in diverse diagnostic approaches using biophysics as a metric. Moreover, novel therapeutic strategies can be based on correcting the apparent malfunction of cell contractility. These applications,&#160;however, require direct quantification of these forces.
We have developed silicone elastomer-based traction force microscopy (TFM) in a parallelized multi-well format. Our use of a silicone rubber, specifically polydimethylsiloxane (PDMS), rather than the commonly employed hydrogel polyacrylamide (PAA) enables us to make robust and inert substrates with indefinite shelf-lives requiring no specialized storage conditions. Unlike pillar-PDMS based approaches that have a modulus in the GPa range, the PDMS used here is very compliant, ranging from approximately 0.4 kPa to 100 kPa. We create a high-throughput platform for TFM by partitioning these large monolithic substrates spatially into biochemically independent wells, creating a multi-well platform for traction force screening that is compatible with existing multi-well systems.
In this manuscript, we use this multi-well traction force system to examine the Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT); we induce EMT in NMuMG cells by exposing them to TGF-&#946;, and to quantify the biophysical changes during EMT. We measure the contractility as a function of concentration and duration of TGF-&#946; exposure. Our findings here demonstrate the utility of parallelized TFM in the context of disease biophysics.

We present a high throughput traction force assay fabricated with silicone rubber (PDMS). This novel assay is suitable for studying physical changes in cell contractility during various biological and biomedical processes and diseases. We demonstrate this method's utility by measuring a TGF-&#946; dependent increase in contractility during the epithelial-to-mesenchymal transition.

عالية الإنتاجية الجر قوة الفحص المجهري باستخدام PDMS يكشف عن الآثار التي تعتمد على الجرعة من تحويل عامل النمو-β على الانتقال الظهاري إلى Mesenchymal

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Bioengineering

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Biology

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

الكشف عن البديل خلال الربط طلائي-الوسيطة الانتقالية

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

التحليل الجزيئي غشائي الوسيطة الانتقالية الناجمة عن تحويل الإشارات عامل النمو-β

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

TGF-β بوساطة البطانية إلى الانتقال المتوسط (EndMT) والتقييم الوظيفي لمؤثري EndMT باستخدام CRISPR/Cas9 تحرير الجينات

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

دراسة TGF-β الإشارة و TGF-β الناجمة عن الظهارية إلى mesenchymal التحول في سرطان الثدي والخلايا الطبيعية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video