ولا تزال عزلة الخلايا الجذعية تشكل تحدياً كبيراً بسبب العزلة المشتركة للخلايا السلف باستخدام الطرق الحالية. طورنا مقايسة خالية من العلامات الحيوية الجديدة لعزل الخلايا الجذعية هادئة من السلف المختلطة. الميزة الرئيسية لهذا على أساس spheroid، التسمية الاحتفاظ المقايسة، فإنه يمكن توسيع وعزل الخلايا الجذعية الحية من ذرية ابنتهم من قبل FACS باستخدام CFSE أو أقصى الأحمر وضع العلامات.
في حين أن العلاجات التقليدية تقضي على معظم خلايا سرطان البروستاتا، فإن الخلايا الجذعية السرطانية تظل بسبب المقاومة العلاجية، مما يؤدي إلى تطور المرض. وستتيح عزل الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية تحديد الجينات الجديدة التي يمكن استهدافها بشكل علاجي مشترك من أجل مغفرة فعالة للمرض. لدينا تصنيف الاحتفاظ بالتسمية للتطبيق لعزل الخلايا الجذعية الطبيعية من الأنسجة والخلايا المختلفة، وأبحاث الخلايا الجذعية السرطانية.
الأهم من ذلك، هذا الفحص ينطبق على سرطانات الخلايا الظهارية الأخرى، مثل سرطان الثدي وسرطان القولون والمستقيم. تبدأ من خلال طلاء الأطباق ثقافة 100 ملليمتر مع ملليلتر اثنين من 2.5 ميكروغرام فيبرومينكين الحل واحتضان لهم بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. ثم الطامح الحل والسماح للأطباق الثقافة الهواء الجاف في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لمدة 45 دقيقة.
أضف تسعة ملليلترات من نمو الخلايا الظهارية في البروستاتا متوسطة إلى طبق مغلف بالليفية وأبقيه دافئًا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. ذوبان قارورة واحدة من الخلايا الظهارية البروستاتا البشرية المجمدة في حمام الماء 37 درجة مئوية، وإعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من المتوسطة الدافئة. الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق.
ثم تُفطّن وتُنبذ المُندفع. resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من المتوسطة ثقافة دافئة ونقل ملليلتر واحد من التعليق مباشرة إلى طبق ليفية المغلفة مع المتوسطة قبل الدافئة. ثم احتضان الطبق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية.
إذا كان co-labeling الخلايا، إعداد الخلايا التي تحمل اسم BrdU في 10 أيام 2D الثقافة كما هو موضح في مخطوطة النص. ثم إضافة خمسة ميكرومولار CFSE أو أحمر الأقصى واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، تعرق بعناية المتوسطة مع الصبغة وغسل الخلايا مرتين مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني دافئ.
بعد ذلك، قم بإجراء الهضم الأنزيمي مع 05٪ تبسين EDTA وفقا لاتجاهات المخطوطة. الطرد المركزي الخلايا في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق والتخلص من افر. تم إعادة وضع الخلايا في الجليد الباردة ، واحد إلى واحد مصفوفة غشاء الطابق السفلي والثقافة المتوسطة مزيج لتشكيل 3D اسطاتوسفير.
لإعداد ثقافة شطلاف الفينيل في نظام مصفوفة 3D الطابق السفلي، ذوبان مصفوفة غشاء الطابق السفلي في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها والاحتفاظ بها على الجليد قبل استخدامها. ثم يضاف بلطف ملليلتر واحد من الجليد الباردة مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى حجم متساو من الجليد الباردة ثقافة المتوسطة. الماصات صعودا وهبوطا لخلط، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء.
Resuspend خمس مرات 10 إلى 1/4 خلايا ظهارية البروستاتا البشرية في الجليد الباردة واحد إلى واحد مصفوفة غشاء الطابق السفلي والثقافة مزيج وسائل الإعلام لحجم إجمالي 500 ميكرولترات. الماصات الحل إلى الحافة السفلية من كل بئر ودوامة لوحة لتوزيع الخليط بالتساوي. ضع الطبق في حاضنة لثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح للمصفوفة بتجمدها.
ثم تغطية مع ملليلتر واحد من ثقافة دافئة المتوسطة في بئر، والتأكد من عدم إزعاج الحلبة. لحصاد prostaspheres المسمى CFSE استبدال المتوسطة مع اثنين من millilits dispalits والماصات صعودا وهبوطا لخلط عدة مرات. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لهضم المصفوفة، ثم جمع خليط الكرة في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر.
الطرد المركزي في المجالات 500 مرة ز لمدة خمس دقائق والتخلص من الفائق. إعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولترات من 05٪ التربسين EDTA الدافئة، ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. احتضان المجالات في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، ثم إضافة 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني دافئ مع 10٪FBS.
مررها من خلال حقنة ذات ملليلتر واحدة بإبرة قياس 26 لتفكّك المجالات تمامًا. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق. ثم تُفطّن وتُنبذ المُندفع.
Resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من متوسطة الثقافة الدافئة مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر بروبديسيوم يوديد لطخة الخلايا الميتة واحتضانها لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. كرر الطرد المركزي، وتجاهل المابير. ثم يغسل الخلايا مع ملليلتر واحد من المتوسطة الدافئة.
كرر الطرد المركزي، وتجاهل المابير. Resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من ثقافة دافئة المتوسطة وجمع الخلايا في أنابيب أسفل البوليسترين جولة خمسة ملليلتر عن طريق تصفية لهم من خلال 35 ميكرون المسام حجم سلالات الخلايا المفاجئة. إجراء تحليل FACS لخلايا بروتسين مُوزعة بـ CFSE التي تحمل اسم "بروستاسفير".
باستخدام الخلايا غير المسماة كتحكم سالب والخلايا المسماة بCFSE كتحكم إيجابي لتعيين البوابات، قم بتشغيل العينة لفرز وتجميع الشعـب الفرعية لخلايا CFSE-high وCFSE-low. تم وضع الخلايا الظهارية الأساسية البشرية العادية في أطباق الثقافة المغلفة بالفيبينينستين وتم الحفاظ على نمو الخلايا في الثقافة 2D. عند نقلها إلى ثقافة ثلاثية الأبعاد مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي ، ماتت الخلايا الظهارية المتمايزة ببطء ولم يبق سوى الخلايا الجذعية البروستاتا.
وأظهرت العلامات المزدوجة للخلايا الظهارية البروستاتا في ثقافة 2D تليها تشكيل كروي في ثقافة 3D كولوكاليسي من BrdU، CFSE، وأحمر فار في نفس الخلايا التسمية الاحتفاظ. وأظهرت ازدواجية المناعة أن الخلايا الاحتفاظ التسمية تحمل مستويات أقل من بروتين السيتوكيراتين الكيراتين 14، وانخفاض بروتين تقاطع الخلايا E-cadherin، وزيادة البروتينات علامة الخلايا الجذعية في وقت مبكر Wnt10b و ALDH1A1، وزيادة بروتين autophagy LC3، وزيادة myosin IIB. وعلاوة على ذلك، فإن مقايسة التسمية القائمة على اللصق، تكتشف بنجاح الخلايا الجذعية السرطانية الشبيهة في عينات سرطان البروستاتا.
عرضت CFSE المسمى الاحتفاظ بالخلايا السرطانية الشبيهة بالربع والزى المشتقة من عينات سرطان البروستاتا البشرية بروتين E-cadherin المنخفض نسبة إلى الخلايا السلف غير المسماة. عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم الحفاظ على مصفوفة في شكل سائل لإعداد الثقافة المتوسطة. تخزينه بين عشية وضحاها في أربع درجات، ونصائح ماصة البرد في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة قبل الاستغناء عن مصفوفة.
بعد عزل الخلايا الجذعية باستخدام مقايسة الاحتفاظ بالتسمية القائمة على الرفو، يمكن إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وتحليل البروتيوم لتحديد جينات محددة وعلامات حيوية جديدة في الخلايا الجذعية. إن عزل الخلايا الجذعية السرطانية الحية من خلال فحص الاحتفاظ بالتسمية القائم على الزاوي يجعل من الممكن للباحثين زراعة الأورام المشتقة من الخلايا الجذعية السرطانية في المختبر وفحص الأدوية الجديدة المضادة للسرطان.
