正确的蛋白浓度的动力学结构与功能分析和亲和力测定的重要性

摘要

我们采用无标记蛋白质相互作用分析利用Biacore X100几个胱抑素乙突变体的结合，木瓜蛋白酶，通过动力学特性的结构与功能分析。无标定浓度分析中心（CFCA）的措施，而不需要为标准曲线与保留结合活性的蛋白浓度。我们表明，浓度使用CFCA增加的动力学分析的可靠性，并能够可靠地确定，即​​使重组蛋白的活性降低，动力学常数确认。

摘要

在这项研究中，我们探索牛半胱氨酸蛋白酶抑制剂胱抑素B和木瓜蛋白酶（图1），植物半胱氨酸蛋白酶的催化活性的形式之间的相互作用，通过实时的无标签使用Biacore X100的分析。几个点突变与木瓜蛋白酶的相互作用等方面的半胱氨酸蛋白酶抑制剂与乙的变种，是生产。对于每个胱抑素乙变种，我们确定其特异性结合的浓度，使用无标定的浓度分析中心（CFCA）和总蛋白浓度获得一个确定的值比较

研究方案

图1的胱抑素B群（蓝色）（黄色）与木瓜蛋白酶的三维结构。突变的胱抑素乙残留以红色显示。

1。标签的自由互动使用Biacore系统的分析原则

在一个典型的无标签结合使用Biacore系统的实验，生物分子被称为“配体”是连接到一个传感器芯片表面。系统带来的流动渠道接触到芯片表面，检测发生的，被称为“分析物”，其约束力的合作伙伴。当分析物的配体结合，积累在表面的质量变化是由表面等离子体共振（SPR）检测。 SPR响应约束力的分析物的量成正比。

由于绑定是在实时测量，动力学协会和为特定的相互作用的解离速率常数才能确定。从这些常量，它是可以计算的平衡解离常数的亲和力。它也可以计算出从稳态数据绑定的亲和力。类似的方法也可以用于确定特异性结合的配体表面的一种蛋白质的浓度。

2。一个蛋白质 - 蛋白质相互作用的动力学特性分析

Biacore X100，可以进行动力学分析，采用单周期动力学。在一个单周期的动力学实验，在一个单一的分析周期的分析物的浓度系列注入的，没有再生的表面之间的注射。因此，单周期动力学，使动力学分析时，很难找到合适的再生条件。

一旦已经收集了动力学实验数据，Biacore X100评估软件生成的数据交互模型拟合的_K A，K _D， 和 K _ð值。

3。以确定蛋白质浓度的方法

分析生物分子间的相互作用是很重要的，了解它们的功能。特征的蛋白质结合其他蛋白质，核酸，小分子生物化学研究的基础，并且发现在许多其他领域，包括药物发现的使用。

两个相互作用的蛋白质之间的相互作用动力学的精确测量，关键是要了解在实验样品分析物的使用的特异性结合蛋白的浓度。一个₂₈₀分光光度计比色法或如读数用人布拉德福德试剂常用来确定总蛋白浓度。然而，蛋白质杂质影响的结果。更重要的是，蛋白质的活动和非活动的形式包括在总蛋白浓度。特别是在重组蛋白，可能无效，由于不正确折叠的情况下，重要的是，以确定样本中的特异性结合蛋白的百分比。

Biacore X100，涉及到具体的结合活性的浓度可以由具有约束力的响应水平相比，从已知的标准，或通过使用最近推出的方法无标定浓度分析中心（CFCA）的校准曲线。 CFCA不依赖于一个标准的。因此，中国金融认证中心是研究蛋白质的突变形式，标准通常是不可用的情况下特别有用。

在一个CFCA实验中，初始结合率是测​​量在不同流速条件下，当样品在芯片表面的扩散速率限制。分析物的扩散系数，是计算从最初的结合^率 1,2特异性结合浓度时，考虑到流通池的尺寸和流速。

在动力学实验，分析物的浓度是用于计算动力学协会速率常数和实验数据的亲和力。 CFCA和Biacore系统的动力学测量都依赖于相同的互动性能。因此，使用浓度Biacore分析确定的特异性结合，而不是总蛋白浓度，增加了结果的可靠性。

4。利用Biacore分析表征之间胱抑素B和木瓜蛋白酶的相互作用

这些蛋白质主要是在涉及nons哺乳动物胱抑素B是可逆的，有竞争力和紧束缚抑制蛋白的木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶，主要是组织蛋白酶B，H，K，L和S。选修细胞内蛋白质的降解。被推定Cystatins不适当的水解细胞和组织，以保障这些酶。他们还从寄生虫和病毒灭活的半胱氨酸蛋白酶，可以参加对这类传染因子的入侵防御。此外，cystatins抑制几种植物半胱氨酸蛋白酶，如木瓜蛋白酶等，这是经常用来作为模型酶的结构与功能研究。胱抑素B群的立体结构与木瓜^蛋白酶 3两种蛋白质之间的相互作用是由疏水性接触占主导地位，其中，从抑制剂方面，提供的N -和C -末端结束，两个发夹环（图1）。在这项研究中，我们研究的C -末端和胱抑素乙结合的第二次循环的重要性，为绑定使用牛胱抑素木瓜乙地区的互动与木瓜中含有点突变的变种。首先，我们确定的四个胱抑素B使用变种的特异性结合的浓度，以及野生型蛋白。积极胱抑素B的特异性结合浓度确定后，野生型和突变的变种结合，以木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶抑制剂乙的速度和亲和常数的测量使用Biacore X100。

5。仪器和试剂

1. Cys3Ser/His75Gly胱抑素乙变种，Cys3Ser/Leu73Gly，Cys3Ser/Tyr97Ala和Cys3Ser产生如前面描述^4。所有突变体包含一个额外的替代位置3丝氨酸，半胱氨酸，防止形成二硫键连接的非活动二聚体的胱抑素B。
2. 木瓜蛋白酶的目标还准备作为先前描述^5。它的S -（甲硫基）木瓜蛋白酶（MMTS - 木瓜蛋白酶），有一个甲硫在活动间隙，使蛋白酶催化不活动组附加到Cys25。
3. Biacore X100加包Biacore X100是用于测量和分析具体的有约束力的浓度和结合动力学。
4. MMTS - 木瓜蛋白酶固定在传感器芯片CM5使用Biacore胺偶联试剂盒。
5. 运行在25 ° C，缓冲区是在pH 7.4 0.01 M羟乙基，0.15 M氯化钠（NaCl），0.0034 M EDTA，0.05％聚山梨酯20。
6. 彼此之间半胱氨酸蛋白酶抑制剂乙的变种，在传感器表面是再生在10μL/ min的流速为30秒与20毫米氢氧化钠。

6.Immobilization的配体MMTS - 木瓜蛋白酶

CFCA分析MMTS - 木瓜蛋白酶共价结合

中国金融认证中心的依赖率分析物分子的表面扩散（大众运输的限制）的限制条件下的结合率的测量。这是由配体的高固定水平的青睐。 MMTS - 木瓜蛋白酶的固定化是建立和运行使用固定Biacore X100控制软件向导。

1. 激活的琥珀酰亚胺（NHS）和碳二亚胺（EDC）为10μL/ min的流速在7分钟的混合物注入流通池2的表面。流单元1保持不变，以作为参考表面。
2. 在50μg/ml注入MMTS - 木瓜蛋白酶在pH 4.5的醋酸钠缓冲液5μL/ min的流速在15分钟。
3. 乙醇胺是在流速10μL/ min的取消余下的积极酯注射7分钟。

整个耦合过程的结果〜3000 RU MMTS - 木瓜蛋白酶固定在流通池2。

共价结合的MMTS - 木瓜蛋白酶的动力学分析

用于固定MMTS - 木瓜蛋白酶的动力学分析，唯一的区别是，动力学分析，固定层次的需求要低，以避免结合率，成为传播有限公司，同样的程序。流单元1留在这一步中没有修改，以及以作为参考表面。

4. MMTS - 木瓜蛋白酶激活与NHS和EDC在7.1的混合物表面后，被注入在1μg/ml为50秒。后，表面上是在步骤7.3乙醇胺注射激活。

耦合度应约50 RU此过程后。

7。确定胱抑素B的浓度，使用中国金融认证中心检测

1. CFCA实验是根据CFCA Biacore X100加包向导成立。约10纳米的蛋白注入流速10和100μL/分钟，一式两份，每份为48秒。每个周期之间，表面上是20毫米氢氧化钠再生。
2. 包括为每个流率的空白注射。
3. 蛋白浓度，然后确定从数据绑定，使用次（图3）中国金融认证中心发送Biacore X100加包评估软件的评价功能。
   
   
   图2。CFCA野生型半胱氨酸蛋白酶抑制剂B.特异性结合的浓度数据分析的结果是在10和100μL/ min的流速获得sensorgrams提取。
   
   
   图3突变体。浓度测定， _使用 280测量（N = 3）和中国金融认证中心（N = 2） 。误差线表示标准误差。摩尔吸光系数计算（6）中所述。可以观察到一个由两种方法确定的Cys3Ser/Leu73Gly突变的浓度值相差较大。
4. 当比较一个由中国金融认证中心_，280测量确定的浓度，它是明确的，而在大多数情况下的蛋白质是完全积极的Cys3Ser/Leu73Gly变种，活性蛋白的比例是非常低（图3 ）。下表显示了胱抑素B相关的总浓度由₂₈₀变体的活动。

   样品	中国金融认证中心在280（％）
   野生型	94
   Cys3Ser/His75Gly	101
   Cys3Ser/Leu73Gly	9
   Cys3Ser/Tyr97Ala	99
   Cys3Ser	83

8。测量结合，以木瓜蛋白酶胱抑素乙动力学

1. 中国金融认证中心测量的基础上，编写了两方面的的一系列浓度从2.5至40纳米，每个胱抑素乙变种。
2. 动力学实验是在Biacore X100使用与单周期方法的动力学向导成立。表面不再生之间的注射，但每个分析周期结束后使用再生液20毫米氢氧化钠。
3. 成立，使每个周期包含示例是一个空循环，缓冲区，而不是样品注入两侧的实验。
4. 使用Biacore X100动力学评价功能，自动履行职权的空白减法减去装修前以1:1的交互模型的数据。
5. 胱抑素乙变种结合木瓜蛋白酶获得的实验数据如图4所示。下表总结了协会和分解速率常数和动力学分析得到的平衡解离常数。

   样品	K A（M -1 s - 1时）	k ð（-1）	ð K（男）
   野生型	1.8 × 10 6	0.41 x 10 -3	2.3 × 10 -10
   Cys3Ser/His75Gly	1.1 × 10 6	1.7 × 10 -3	1.5 × 10 -9
   Cys3Ser/Leu73Gly	1.1 × 10 6	23 × 10 -3	2.2 × 10 -8
   Cys3Ser/Tyr97Ala	1.7 × 10 6	12 × 10 -3	7.1 × 10 -9
   Cys3Ser	0.9 × 10 6	0.53 x 10 -3	5.8 × 10 -10

   
   
   
   图4。胱抑素乙变种MMTS -木瓜蛋白酶的结合动力学配 ​​置文件确定使用单周期动力学。 Sensorgrams显示空白和参考减去动能适合1:1的互动模式覆盖在黑色的数据。
6. 协会率的突变体与野生型蛋白（图5，上游面板），解离速率常数的突变体，可以接近两个数量级，与相应的平衡解离增加固定（图5，下半部分）。
   
   
   图5。率和亲和常数的计算是基于从中国金融认证中心获得的浓度。 _K A，K _ð K _ð与相关的基因突变，变化是描绘在图形。
7. 它是由于样品浓度是在从实验数据的关联率不断的计算参数，重要的是，它是正确的的。使用CFCA测量，而不是一个₂₈₀的浓度会得出这样的结论，Leu73协会率，其中更换似乎导致约10倍速度比其他半胱氨酸蛋白酶抑制剂乙变种协会是非常重要的。然而，特异性结合浓度测量由中国金融认证中心是在这种情况下，总蛋白，只有约10％。这是考虑到这一点变得清晰Leu73协会率是类似的其他变种。因此，中国金融认证中心允许_K A和 K _ð从而使可能的互动机制的适当的解释正确评估。

讨论

在这项工作中，四突变体和野生型半胱氨酸蛋白酶抑制剂乙生产的，以评估的第二约束力循环的重要性和C -端之间胱抑素B和木瓜蛋白酶的相互作用结束。这项研究表明优势和易于使用Biacore X100，以确定具体的的具有约束力的浓度和蛋白质相互作用的动力学分析，以了解结构与功能的关系。我们发现，测量总蛋白浓度不露的蛋白质结合活性降低，在这种情况下引入了一个明显的测量误差在确定结合的亲和力和动力学的变种。胱抑素乙变种的特异性结合的浓度进行了测定与Biacore X100使用中国金融认证中心。由中国金融认证中心作为输入的动力学分析使用浓度测量结果可靠率和亲和常数，从而使正确的解释的互动机制。

的突变体的亲和力下降几乎完全是由于增加 _{k D}值， _而 k的影响只是轻微。这种行为表明，第二约束力环区和C末端的木瓜蛋白酶抑制剂的结合率的重要。相反，它们有助于亲和力，主要通过保持连接酶抑制剂，已经形成了复杂的一次。

材料

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Biacore™ X100 System		GE Healthcare	BR-1100-73	http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html
Biacore™ X100 Plus Package		GE Healthcare	BR-1007-98	http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html
Sensor Chip CM5		GE Healthcare	BR-1000-14	http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html
Amine Coupling Kit		GE Healthcare	BR-1000-50
Acetate buffer pH 4.5, 50 ml		GE Healthcare	BR-1003-50
HBS-EP+ buffer 10X, 4 x 50 ml		GE Healthcare	BR-1008-26
Plastic Vials Ø 11 mm		GE Healthcare	BR-1002-87
Rubber caps, type 2		GE Healthcare	BR-1004-11