Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

Özet

Biz geçerlidir etiket kinetik karakterizasyonu ile papain birkaç sistatin B mutantlar bağlayıcı yapı-işlev analizi için ücretsiz Biacore X100 kullanarak protein etkileşim analizi. Kalibrasyon konsantrasyon analizi (CFCA) standart eğri gerek kalmadan muhafaza bağlayıcı aktivite ile protein konsantrasyonu ölçer. Biz CFCA kinetik analiz güvenilirliğini artırır ve bu kinetik sabitler güvenilir bir rekombinant proteinin aktivitesi azalır bile tespit edilebilir kullanarak bu onay konsantrasyonlarının göstermektedir.

Özet

Bu çalışmada, biz Biacore X100 kullanarak gerçek zamanlı etiket analizi, sığır sistein proteaz inhibitörü sistatin B ve bir bitki sistein proteaz papain (Şekil 1), katalitik olarak inaktif bir formu arasındaki etkileşim keşfetmek. Papain ile etkileşim alanları ile birkaç nokta mutasyonlarının sistatin B türevleri üretilmektedir. Her sistatin B varyantında için kalibrasyon konsantrasyon analizi kullanarak kendine özgü bağlayıcı konsantrasyonu (CFCA) belirlemek ve A tarafından belirlenen total protein konsantrasyonu ile elde edilen değerleri karşılaştırmak

Protokol

Şekil 1 papain ile sistatin B kompleks (mavi) (sarı), üç boyutlu yapısı. Mutasyona uğramış sistatin B artıkları kırmızı renkte gösterilmiştir.

1. Biacore Sistemleri kullanarak Etiket Etkileşim Analizi İlkeleri

Biacore sistemini kullanarak tipik bir etiket bağlayıcı deneyde, biyomolekülün 'ligand' bir sensör çipi yüzeyinde bağlı olarak nitelendirdi. Bir akış kanalları sistemi, algılama yer alan yonga yüzeyi ile temas 'analit' olarak adlandırılan bağlayıcı ortağı getiriyor. Analit ligand bağlanır, yüzeyde biriken kitle olarak ortaya çıkan değişim yüzey plazmon rezonans (SPR) tarafından tespit edilmiştir. SPR yanıt bağlayıcı analit miktarı ile doğru orantılıdır.

Bağlayıcı gerçek zamanlı olarak ölçülmeye başladığından beri, kinetik dernek ve belirli bir etkileşim için disosiasyon hız sabitleri tespit edilebilir. Bu sabitleri, yakınlık denge asitlik sabiti olarak hesaplamak mümkündür. Bu kararlı durum veri bağlama yakınlık hesaplamak için de mümkündür. Benzer bir yöntem de, yüzey üzerinde özel bir ligand bağlanır bir protein konsantrasyonu belirlemek için kullanılır.

2. Bir protein-protein etkileşimleri kinetik özellikleri analizi

Biacore X100, kinetik analiz tek döngüsü kinetiği kullanılarak yapılabilir. Tek bir döngüsü kinetik deneyde, analit konsantrasyonu serisi enjeksiyonlar arasındaki yüzey yenilenme olmadan tek bir analiz döngüsü enjekte edilir. Uygun yenilenme koşulları bulmak zordur Bu nedenle, tek-döngüsü kinetiği, kinetik analiz sağlar.

Kinetik bir deney için veriler tahsil edildikten sonra, Biacore X100 değerlendirme yazılımı bir etkileşim modeli veri uyan _k, k, _d ve K _D değerleri üretir.

3. Protein Konsantrasyonu Belirlenmesi Yaklaşımlar

Biyomoleküllerin arasındaki etkileşimler incelendiğinde, kendi işlevlerini anlamak için önemlidir. Nükleik asit bağlayıcı proteinlerin diğer proteinleri karakterize, ya da küçük moleküllerin biyokimyasal araştırma için temel ve ilaç keşfi de dahil olmak üzere diğer birçok alanda kullanım bulur.

Iki etkileşen proteinler arasındaki etkileşim kinetiği doğru ölçümü için analit olarak kullanılan deneysel örnek özellikle bağlayıcı protein konsantrasyonu bilmek şarttır. A ₂₈₀ veya kolorimetrik testleri gibi bir spektrofotometre okuma Bradford reaktifi istihdam genellikle total protein konsantrasyonu belirlemek için kullanılır. Ancak, protein kirleri sonucu etkileyebilir. Daha da önemlisi, protein hem aktif ve inaktif formları, total protein konsantrasyonu dahildir. Özellikle yanlış katlanması nedeniyle inaktif olabilir rekombinant proteinlerin, durumunda, bu örnek özel bağlayıcı protein yüzdesini belirlemek önemlidir.

Biacore X100, belirli bağlayıcı aktivite ilgili konsantrasyon ya bilinen bir standart ya da daha yakın bir zamanda tanıtıldı metodoloji Kalibrasyon Konsantrasyon Analizi (CFCA) kullanılarak elde edilen kalibrasyon eğrisi için bağlayıcı tepki düzeylerinin karşılaştırılması ile belirlenir. CFCA bir standarda bağlı değildir. Bu nedenle, CFCA standartlar genellikle mevcut değildir proteinlerin mutant formları, eğitim söz konusu olduğunda özellikle yararlıdır.

Çip yüzeyine örnek difüzyon hızı sınırlayıcı bir CFCA deneyde, ilk bağlama oranı koşullarda farklı debilerde ölçülen. İlk bağlama oranı ^1,2 belirli bağlayıcı konsantrasyonu hesaplanırken analitin difüzyon katsayısı, akış hücresi ve akış oranları boyutları dikkate alınır.

Kinetik deneyde, analit konsantrasyonu kinetik örgütlenme oranı sürekli ve deneysel veriler yakınlığı hesaplanmasında kullanılır. CFCA ve Biacore sistemlerde kinetik ölçüm hem de aynı etkileşim özelliklerine güveniyor. Bu nedenle, Biacore analizi tarafından belirlenen belirli bağlayıcı konsantrasyonu, yerine toplam protein konsantrasyonu, sonuçların güvenilirliğini artırır.

4. Sistatin B ve Papain Arasında Etkileşim Karakterizasyonu için Biacore analizi kullanarak

Memeli sistatin B Bu proteinler başlıca nons katılan papain sistein proteinazı gibi, öncelikle katepsin B, H, K, L ve S. geri dönüşümlü, rekabetçi ve sıkı bağlayıcı protein inhibitörüseçmeli hücre içi protein parçalanması. Cystatins bu enzimler tarafından uygunsuz proteoliz hücre ve dokuları korumak için olduğu tahmin ediliyor. Ayrıca, parazitler ve virüsler sistein proteinazı inaktive gibi enfeksiyöz ajanların işgaline karşı savunma katılabilir. Buna ek olarak, cystatins, papain olarak sık sık bir model enzim yapı-işlev çalışmalarında olarak kullanılan birkaç bitki sistein proteinazı, inhibe ederler. Inhibitörü taraftan, N-ve C-terminal uçları ve iki adet saç tokası döngüler tarafından sağlanan, hidrofobik kişiler, iki protein arasındaki etkileşimi hakim olduğu papain ³ gösterileri ile sistatin B kompleks üç boyutlu yapısı ( Şekil 1). Bu çalışmada, sığır sistatin kullanarak papain bağlama için C-terminal uç ve sistatin B ikinci bağlayıcı döngü önemini incelemek papain ile etkileşim alanlarında nokta mutasyonları içeren B varyasyonları. Biz belirli bağlayıcı kullanılan dört sistatin B türevleri konsantrasyon, vahşi tip proteinin yanı sıra ilk kez belirler. Aktif sistatin B belirli bağlayıcı konsantrasyonu belirlendikten sonra, yabani tip ve mutant türevleri sistatin B papain için bağlayıcı oranı ve sıhri sabitleri Biacore X100 kullanılarak ölçülür.

5. Cihaz ve Reaktifler

1. Sistatin B türevleri Cys3Ser/His75Gly, Cys3Ser/Leu73Gly Cys3Ser/Tyr97Ala ve Cys3Ser önceden ⁴ açıklanan üretilmektedir. Tüm mutantlar sistatin B. disülfit bağlantılı inaktif dimerleri oluşumunu önlemek için, konumu 3 serin için ek bir ikame sistein içerir
2. Daha önce ⁵ açıklandığı gibi papain hedefi de hazırlanır. S-(methylthio), katalitik olarak inaktif proteaz render aktif yarık Cys25 bağlı bir methylthio grubuna sahip papain (MMTS papain).
3. Biacore X100 Plus Paketi ile Biacore X100, belirli bağlayıcı konsantrasyonu ve bağlayıcı kinetiği ölçmek ve analiz etmek için kullanılır.
4. MMTS papain Biacore Amine Kaplin Kiti kullanarak Sensör Çip CM5 immobilize.
5. Çalışır, 25 ° C'de ve tampon pH 7.4 'de 0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0,0034 M EDTA, ve% 0.05' polisorbat 20.
6. Sistatin B her varyant arasında, sensör yüzeyi 10 ul / dk akış hızında 30 saniye süreyle 20 mM NaOH ile yeniden oluşturulur.

Ligand MMTS-papain, 6.Immobilization

Kovalent eklenti MMTS-papain CFCA analizi

CFCA analit molekülleri yüzeye difüzyon (toplu taşıma sınırlaması) oranı ile sınırlı koşullar altında bağlama oranı ölçümü dayanmaktadır. Bu ligand yüksek immobilizasyon seviyeleri tarafından tercih edilmektedir. MMTS-papain immobilizasyonu kurmak ve Biacore X100 Control yazılımı immobilizasyon sihirbazı kullanarak çalışacak.

1. Succinimide (NHS) ve carbodiimide (EDC) 7 dakika 10 ul / dk akış hızında bir karışımı enjeksiyon yüzey akış hücresi 2 etkinleştirin. Flow hücre 1 referans yüzey olarak kullanılmak üzere değiştirilmeden bırakılır.
2. 50μg/ml az 5 ul / dk akış hızında 15 dakika boyunca pH 4.5 sodyum asetat tamponunda MMTS-papain enjekte edilir.
3. Etanolamin 7 dakika 10 ul / dk kalan aktif esterleri devre dışı bırakmak için bir akış hızında enjekte edilir.

Tüm kaplin prosedürü neden ~ 3000 akış hücresi 2 immobilize RU MMTS-papain.

Kinetik analizi için MMTS-papain Kovalent eklenti

Tek fark kinetik analizi, immobilizasyon düzeyinde bağlayıcı oranı difüzyon ile sınırlı olma önlemek için düşük gerektiğini, kinetik analizi için MMTS-papain hareketsizleştirir için aynı prosedürü kullanılır. Flow hücre 1 referans yüzey olarak kullanılmak üzere de bu adımı değiştirilmeden bırakılır.

4. 7.1 'NHS ve EDC karışımı ile yüzey aktivasyonu sonra, MMTS papain 50 saniye için 1μg/ml enjekte edilir. Bundan sonra yüzey etanolamin adım 7.3 gibi bir enjeksiyon ile de aktive edilir.

Kaplin bu işlemden sonra yaklaşık 50 RU olmalıdır.

7. CFCA testi kullanılarak belirlenmesi Sistatin B konsantrasyonu

1. CFCA deney Biacore X100 Plus Paket CFCA sihirbazı göre ayarlanır. Yaklaşık 10 nM protein akış hızları 10 ve 100 ul / dak 48 saniye için yinelenen enjekte edilir. Yüzeyi her çevrim arasındaki 20 mM NaOH ile yeniden oluşturulur.
2. Her akış hızı için boş enjeksiyonları içerir.
3. Protein konsantrasyonu daha sonra th kullanarak veri bağlama (Şekil 3) tespitBiacore X100 Plus Paket değerlendirme yazılımı e CFCA değerlendirme özelliği.
   
   
   Şekil 2, 10 ve 100 ul / dak akış hızlarında elde edilen sensorgrams CFCA yabani tip sistatin B. belirli bağlayıcı konsantrasyon verileri analiz sonuçları elde edildi .
   
   
   Şekil 3 mutantlar. Konsantrasyonlar ₂₈₀ ölçümü (n = 3) ve (n = 2) CFCA kullanılarak belirlendi. Standart hatalar, hata çubuklarla gösterilir. (6) açıklandığı gibi azı emme katsayıları hesaplandı. Iki yöntem tarafından belirlenir Cys3Ser/Leu73Gly mutant konsantrasyon değerleri büyük bir fark görülebilir.
4. CFCA tarafından A ₂₈₀ ölçümü ile belirlenen konsantrasyon kıyaslarken, çoğu durumda protein Cys3Ser/Leu73Gly varyant, tamamen aktif iken, aktif protein fraksiyonu (Şekil 3) çok düşük olduğu, bu açıktır. Aşağıdaki tablo, _bir 280 toplam konsantrasyonları ile ilgili sistatin B türevleri faaliyetleri gösterir .

   Örnek	A 280 (%) ile ilgili olarak CFCA
   Vahşi tip	94
   Cys3Ser/His75Gly	101
   Cys3Ser/Leu73Gly	9
   Cys3Ser/Tyr97Ala	99
   Cys3Ser	83

8. Ölçüm Papain bağlayıcı Sistatin B Kinetiği

1. CFCA ölçümlere göre, 2.5 sistatin B türevleri her biri için 40 nM arasında değişen bir iki kat konsantrasyon serisi hazırlamak.
2. Kinetik deneyi Biacore X100 kinetik sihirbazını kullanarak tek döngüsü yaklaşımı ile kurulur. Enjeksiyonlar arasındaki yüzey rejenere, ancak her analiz döngüsünün sona ermesinden sonra yenilenme çözüm olarak 20 mM NaOH kullanılarak değildir.
3. Örnek içeren her döngüsü örnek yerine tampon enjekte edilir, boş bir döngü ile çevrili, böylece deney ayarlayın.
4. Biacore X100 kinetik değerlendirme özelliği otomatik olarak referans boş çıkarmalar gerçekleştirmek için kullanın 1:1 etkileşim modeli takmadan önce veri çıkarılır.
5. Papain için sistatin B türevleri bağlama için elde edilen deneysel veriler Şekil 4'te gösterilmiştir. Aşağıdaki tabloda, dernek ve disosiasyon oranı sabitler ve kinetik analiz elde edilen denge ayrılma sabitleri özetlemektedir.

   Örnek	k bir (M -1 s -1)	k d (s -1)	K-Ge (M)
   Vahşi tip	1.8 x 10 6	0.41 x 10 -3	2.3 x 10 -10
   Cys3Ser/His75Gly	1.1 x 10 6	1,7 x 10 -3	1.5 x 10 -9
   Cys3Ser/Leu73Gly	1.1 x 10 6	23 x 10 -3	2.2 x 10 -8
   Cys3Ser/Tyr97Ala	1.7 x 10 6	12 x 10 -3	7,1 x 10 -9
   Cys3Ser	0.9 x 10 6	0.53 x 10 -3	5,8 x 10 -10

   
   
   
   Şekil 4 MMTS-papain bağlayıcı sistatin B varyasyonları için kinetik profilleri tek çevrim kinetiği kullanılarak belirlenmiştir. Sensorgrams boş ve gösteri referans siyah, üst üste 01:01 etkileşim modeli için kinetik oturuş veri çıkarılır.
6. Mutantların dernek oranları vahşi tip proteini (Şekil 5, üst panel) ile karşılaştırılabilir olmasına rağmen, mutantlar ayrışma hız sabitleri denge disosiasyon karşılık gelen bir artış, yakın büyüklükte iki sipariş yüksek olabilir sabit (Şekil 5, alt panel).
   
   
   Şekil 5 oranı ve yakınlık sabitleri hesaplamalar CFCA elde edilen konsantrasyonları dayalı idi. Mutasyonları ile ilişkili _k, k _d ve K _D değişiklikler grafikler tasvir edilmektedir.
7. Örnek konsantrasyonu deneysel veriler sabit dernek oranının hesaplanmasında bir parametre olduğundan,doğru olması önemlidir. Leu73 yerine CFCA A ₂₈₀ ölçüm dayalı konsantrasyonu kullanarak değiştirme diğer sistatin B türevleri yaklaşık 10 kat daha yavaş dernek gibi görünüyor dernek oranı, önemli olduğu sonucuna yol açacak. Ancak, CFCA tarafından ölçülen belirli bağlayıcı konsantrasyonu sadece yaklaşık% 10 bu durumda total protein. Bu dikkate alındığında Leu73 için dernek oranı diğer varyantları benzer olduğunu açık hale gelir. Bu nedenle, CFCA, böylece etkileşim mekanizmasının uygun yorumlanması _mümkün k ve _K D doğru bir şekilde değerlendirilmesi için sağlar .

Tartışmalar

Bu çalışmada, dört mutantlar ve yabani tip sistatin B ikinci bağlayıcı döngünün önemini değerlendirmek ve C-terminal sistatin B ve papain arasındaki etkileşimi sona amacıyla üretildi. Bu çalışmada, belirli bağlayıcı konsantrasyonu belirlemek ve protein-protein etkileşimleri kinetiği yapı-işlev ilişkileri anlamak için analiz Biacore X100 kullanmanın avantajı ve kolaylığı göstermiştir. Biz total protein konsantrasyonu ölçüm Bu durumda afinitesi ve kinetiği belirlenmesinde önemli bir ölçüm hatası tanıttı bağlanma aktivitesi azalır, protein çeşitleri çıkmamasına gösterdi. Sistatin B türevleri belirli bağlayıcı konsantrasyonu Biacore X100 CFCA kullanarak tespit edildi. Kinetik analizi için girdi olarak CFCA konsantrasyon ölçümlerinin kullanılması, böylece etkileşim mekanizmasının doğru yorumlanması sağlayan, güvenilir oranı ve yakınlık sabitleri sonuçlandı.

_K sadece biraz etkilenir iken mutant azalma akrabalıklar, neredeyse sadece bir artış k _d-değeri nedeniyle. Bu davranış, ikinci bağlayıcı döngü bölge ve C-terminal uç inhibitörü papain için bağlayıcı oranı için önemli olmadığını gösterir. Bunun yerine, öncelikle karmaşık oluşmuş bir kez inhibitörü enzim bağlı tutarak afinitesi katkıda bulunur.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biacore™ X100 System	GE Healthcare	BR-1100-73	http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html
Biacore™ X100 Plus Package	GE Healthcare	BR-1007-98	http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html
Sensor Chip CM5	GE Healthcare	BR-1000-14	http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR-1000-50
Acetate buffer pH 4.5, 50 ml	GE Healthcare	BR-1003-50
HBS-EP+ buffer 10X, 4 x 50 ml	GE Healthcare	BR-1008-26
Plastic Vials 11 mm	GE Healthcare	BR-1002-87
Rubber caps, type 2	GE Healthcare	BR-1004-11