RhoC的GTP酶激活法

摘要

该协议利用上拉下来检测，以确定细胞内的活动中RhoC GTP酶的水平。

摘要

RhoC的GTP酶有91％的同源性GTP酶RhoA的。由于其在细胞中的患病率，许多试剂和GTP酶RhoA的技术已经开发出来。然而，RhoC的GTP酶表达的转移性癌细胞处于较低水平。因此，数RhoC的特定试剂已经开发出来。我们已经适应了一个Rho的激活检测，检测RhoC的GTP酶。这种技术利用商品及服务税的Rho结合结构域融合蛋白拉出积极RhoC的GTP酶。此外，我们可以在检测开始收获总蛋白，以确定总水平（GTP和GDP结合）RhoC的GTP酶。这使得主动与总RhoC的GTP酶在细胞中的决心。此过程中的几个商业版本，但是已经开发，商业试剂盒优化GTP酶RhoA的，通常不工作中RhoC GTP酶。检测的部分已被修改，以及作为一个RhoC的特异性抗体的发展。

研究方案

1。准备GST融合蛋白

1. JM109感受态细菌，包含第一的N -端90个氨基酸的rhotekin Rho的结合域（RBD）的进入BamH1/EcoR1 pGEX3x载体亚克隆酸甘油。
   
   为了确保高效率，必须执行以下步骤，每个实验。根据我们的经验，新鲜的GST - RBD的是一个强大的和准确的GTP酶激活检测的关键。
2. 加入50微升（近似的，没有解冻）甘油50毫升的LB放大器和成长37℃摇动过夜。
3. 1:10稀释500毫升LB放大器，并成长为1小时
4. 0.1 mM的IPTG的2小时诱导的GST -蛋白生产。
5. 离心瓶，离心，Sorval GSA3转子均匀分布在5000 RPM的4 ° C下20分钟。
6. 离心瓶，10 mL裂解缓冲液中的悬浮颗粒*。
   *细菌细胞裂解液：20％的蔗糖，10％甘油，50毫米的Tris pH值8.0，0.2毫米的_{Na 2 S 2 O} 5，2毫米，2毫米的DTT MgCl ₂的，添加新鲜的PMSF，苯甲酰胺，抑肽酶和亮肽素。
7. 超声2-3分钟（这取决于sonicator类型，我们使用一个菲舍尔声波Dismembranator 500型商标6集，50％的周期）。
8. 离心机，Sorvall SS34，20分钟10,000转，4 ° C。此时可以采取的一个小等分，并经SDS - PAGE运行。凝胶可以考马斯染色，应在46 kDa的乐队明显。
9. 去除上清液，加入1毫升50％glutatione琼脂糖4B浆。
10. 孵育30分钟，在4 °旋转彗星。裂解缓冲液洗3次。
11. 重悬GST-RBD/glutatione-Sepharose珠50％的浆料（约1毫升），GST鱼缓冲区** ** GST鱼缓冲液：10％甘油，50毫米的Tris pH值7.4，氯化钠100毫米，1％NP - 4，2毫米氯化镁_2，添加新鲜的PMSF，苯甲酰胺，抑肽酶和亮肽素

2。 GST融合下拉检测

1. 使用5-10 × 10 ⁶细胞/检测
2. 洗涤细胞一次在冰冷的PBS，保持冰板（我们使用平面的玻璃皿盛满冰块）和裂解0.5毫升GST鱼缓冲区。
3. 在冰上孵育5分钟，收获细胞，用橡胶警察或平刮板，转移到离心管和离心机20,000 RPM 5分钟，在4 ° C。
4. 上清转移到一个新的离心管。取50μL，以确定总的Rho（即国内生产总值+ GTP的约束）。
5. 加入0.5毫升GST-RBD/glutatione-Sepharose珠，并在4 ° C孵育，用旋转过夜。
6. 洗与GST鱼缓冲区的6倍。
7. 在40μL2X - Laemelli样品缓冲液重悬珠
   此时浓度的确定应采取的总的Rho蛋白在2.4等分和30微克准备在凝胶上运行相应的激活范例。
8. 煮沸样品在90 ° C为5分钟，离心，取上清液（即避免珠）负载和12个4-20％梯度SDS - PAGE凝胶上运行。
9. 运行在不高于150伏凝胶转移到膜的使用Towbin缓冲区和常量100 W
10. 座与5％的奶粉/ TBST解决方案和探头中RhoC - specfic抗体的膜。

3。代表性的成果

良好的效果，产生约22 kDa的单波段。坏的结果产生多个频段或高背景。这是蛋白质的降解，不完整的样品洗涤或使用旧GST - RBD的指示。

图1显示三个独立的细胞株，表达RhoC的GTP酶的不同层次表现出积极和总RhoC的高层次，积极和总RhoC的或没有RhoC的水平低。然后剥离印迹和看家基因肌动蛋白的抗体，作为一个总RhoC蛋白的装载的控制reprobed。

图2多个频段或高蛋白质的降解，不完整的样本的洗涤或使用旧GST - RBD的背景。

讨论

该过程最关键的一步，是新鲜的GST - RBD的一代。密切关注到了这一步的失败是失败的主要原因。所有步骤，从GST - RBD的一代（1.2）孵育过夜的细胞裂解液（2.5），应在一天内完成。另一个关键的一步就是让某些有足够的细胞产生的细胞裂解液。这是在RhoC的GTP酶，它往往是在细胞水平低时，具有特别重要的意义。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gluthione-sepharose 4B beads	GE Healthcare	17-0756-01
Criterion 4-20% Tris-HCl gels	Bio-Rad	345-0032