RhoC GTPaz Etkinleştirme Testi

Özet

Bu protokol, hücre içinde aktif RhoC GTPaz düzeylerini belirlemek için tahlil aşağı çekme kullanır.

Özet

RhoC GTPaz RhoA GTPaz% 91 homoloji vardır. Çünkü hücreleri yaygınlığı, RhoA GTPaz için birçok reaktifler ve teknikleri geliştirilmiştir. Ancak, RhoC GTPaz nispeten düşük seviyelerde metastatik kanser hücrelerinin ifade edilir. Bu nedenle, birkaç RhoC özel reaktifler geliştirilmiştir. Biz RhoC GTPaz tespit etmek için bir Rho aktivasyon tahlil adapte var. Bu teknik aktif RhoC GTPaz çekin bir GST-Rho bağlayıcı etki alanı füzyon proteini kullanır. Buna ek olarak, toplam düzeyleri (GTP ve GSYİH bağlı) RhoC GTPaz belirlemek için testin başında total protein hasat. Bu hücre aktif karşı toplam RhoC GTPaz belirlenmesi için sağlar. Ancak, bu prosedürün birçok ticari sürümleri geliştirilmiştir, ticari kitleri RhoA GTPaz için optimize edilmiştir ve genellikle RhoC GTPaz için iyi bir sonuç vermez. Testinin parçaları RhoC-spesifik antikor gelişimi yanı sıra modifiye edilmiştir.

Protokol

1. Hazırlayın ve GST-füzyon protein

1. BamH1/EcoR1 pGEX3x vektör içine subcloned rhotekin Rho bağlayıcı etki alanı (RBD) ilk 90 N-terminal amino asitleri içeren JM109 yetkili bakterilerin Gliserol stokları yapılır.
   
   Yüksek verim sağlamak için aşağıdaki adımları, her bir deney için yapılmalıdır. Deneyimlerimize göre, taze GST-RBD sağlam ve doğru bir GTPaz aktivasyon tahlil için anahtar hazırlanmıştır.
2. Gliserol stokunun LB amp 50 ml (yaklaşık, Çözülme yok) 50 mcL ekleyin ve titreme ile 37 ° C gecede büyümek.
3. 500 ml LB-amp 01:10 seyreltilir ve 1 saat boyunca büyümek
4. 2 saat için 0.1 mM IPTG GST-protein üretimini uyarır.
5. 5000 santrifüj şişe ve santrifüj, Sorval GSA3 rotor içine eşit olarak dağıtın RPM 4 ° C 20 dak.
6. Santrifüj şişe içinde süspanse edin pelet, 10 ml lizis tampon *.
   * Bakteriyel Lizis Tamponu:% 20 Sakkaroz,% 10 gliserol, 50 mM Tris, pH 8.0, 0.2 mM ₂ S ₂ O _5, 2 mM MgCl _{2, 2} mM DTT, Na, taze PMSF benzamid, aprotinin ve leupeptin ekleyin.
7. 2-3 dk (sonikatör türüne bağlıdır. Işareti 6 ayarlanmış bir Fischer Sonic Dismembranator Model 500,% 50 döngüsü) sonikasyon.
8. 4 Santrifüj, Sorvall SS34 20 dakika 10.000 rpm ° C Bu noktada küçük bir kısım alınması ve SDS-PAGE ile çalışır. Jel Coomassie boyanmış olabilir ve bir grup 46 kDa belirgin olmalıdır.
9. Süpernatantı ve 1 ml% 50 glutatione-sepharose 4B bulamaç ekleyin.
10. 30 dakika 4 ° C'de rotasyon ile. Lizis tamponu ile 3 kere yıkayın.
11. GST-balık tamponu ile (yaklaşık 1 ml)% 50 bulamaç GST-RBD/glutatione-Sepharose boncuk yeniden süspanse **. ** GST-Balık Tampon:% 10 Gliserol, 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl,% 1 NP-4, 2 mM MgCl _2, taze PMSF benzamid, aprotinin ve leupeptin

2. GST-fusion tahlil aşağı çekme

1. 5-10 x 10 ⁶ hücre / tahlil kullanın .
2. Kez, buz PBS, buz üzerinde plakaları tutmak (buz dolu bir düz cam tabak kullanın) ve 0.5 mL GST-balık tampon lyse hücreleri yıkayın.
3. 5 dakika buz üzerinde inkübe, hasat hücreleri kullanarak lastik bir polis ya da düz dozajlama, tüp mikrofuge'de transferi ve 4 20,000 rpm 5 dakika santrifüj ° C
4. Süpernatant taze bir mikrofuge'de tüpüne aktarın. Toplam Rho (yani GSYİH + GTP sınır) belirlemek için 50 mcL alın.
5. 0.5 mL GST-RBD/glutatione-Sepharose boncuk ekleyin ve 4 geceleme rotasyon ile ° C inkübe.
6. GST-balık tampon 6x yıkayın.
7. 40 mcL 2x-Laemelli örnek tampon yeniden süspanse boncuk
   Bu noktada 2.4 'te alınan toplam Rho protein kısım konsantrasyonu belirlenir ve 30 mikrogram karşılık gelen aktivasyon örnek jel üzerinde çalıştırmak için hazırlanmalıdır.
8. Kaynatın örnekleri 90 ° C, 5 dakika için, kısaca santrifüj ve 12% 4-20 degrade SDS-PAGE jel supernatant (yani boncuk önlemek) yük almak ve çalıştırmak.
9. 100 W Towbin tampon ve sabit akım kullanılarak membran transferi, daha yüksek 150 volt jel çalıştırın
10. RhoC specfic antikor% 5 süt / TBST çözüm ve prob ile membran engelleyin.

3. Temsilcisi Sonuçlar

Iyi sonuçlar tek bir grup yaklaşık 22 kDa üretmek gerekir. Kötü sonuçlar, çoklu bantları ya da yüksek arka plan üretir. Bu protein bozulması, örneklerin eksik yıkama veya eski GST-RBD göstergesidir.

Şekil 1. Üç ayrı hücre hatları RhoC GTPaz farklı düzeylerde ifade aktif ve toplam RhoC, yüksek düzeyde aktif ve toplam RhoC ya da hiç RhoC düşük seviyelerini göstermek için gösterilmiştir. Blot sonra elimden ve ev tutmak gen aktin bir antikor ile toplam RhoC protein yükleme kontrol olarak hizmet reprobed oldu.

Şekil 2. Çoklu bantlar veya yüksek protein bozulması, örnekleri eksik yıkama veya eski GST-RBD arka plan .

Tartışmalar

Prosedürün en kritik adım, taze GST-RBD nesil. Bu adımı yakın ilgi ödenmemesi başarısızlığın ana nedeni budur. GST-RBD (1.2) üretimi hücre lizatı (2.5) ile gecelik inkübasyon tüm adımları tek bir gün içinde yapılmalıdır. Bir diğer önemli adım, hücre lizatları üretmek için yeterli hücre vardır emin olun. RhoC GTPaz, hücre düşük seviyelerde bulunan olma eğilimindedir bakarken özel bir önem taşımaktadır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gluthione-sepharose 4B beads	GE Healthcare	17-0756-01
Criterion 4-20% Tris-HCl gels	Bio-Rad	345-0032