RhoC GTPアーゼ活性化アッセイ

要約

このプロトコルは、細胞内のアクティブなRhoC低分子量GTPaseのレベルを決定するためにプルダウンアッセイを利用しています。

要約

RhoC GTPアーゼは、RhoAのGTPアーゼ〜91％の相同性を持っています。ために細胞内での有病率から、RhoAのGTPアーゼのための多くの試薬および技術が開発されている。しかし、RhoC GTPアーゼは、比較的低レベルでの転移性癌細胞に発現している。したがって、少数のRhoC固有の試薬が開発されている。私たちはRhoC低分子量GTPaseを検出するためのRho活性化アッセイを適応している。この手法は、アクティブなRhoC GTPアーゼを引き出すためにGST - Rhoの結合ドメイン融合タンパク質を利用しています。さらに、我々は全体のレベル（GTPおよびGDP結合）RhoCのGTPアーゼを決定するアッセイの開始時に総タンパク質を収穫することができます。これは、セル内のアクティブな対総RhoC GTP加水分解酵素の測定が可能になります。この手順のいくつかの商用バージョンがしかし、市販のキットはRhoAのGTP加水分解のために最適化されており、通常はRhoC GTPアーゼのためにうまく動作しない開発されています。アッセイの部分はRhoC特異的抗体の開発だけでなく、変更されています。

プロトコル

1。 GST -融合タンパク質を準備

1. BamH1/EcoR1 pGEX3xベクターにサブクローニングrhotekinのRho結合ドメイン（RBD）の最初のN末端90アミノ酸を含むJM109コンピテント細菌のグリセロールストックが行われます。
   
   高効率を確保するために、次の手順は、各実験のために実行しなければなりません。我々の経験では、新しく調製したGST - RBDは、堅牢で正確な分子量GTPase活性化アッセイの鍵となります。
2. LBアンプ50mlにグリセロールストックのμL50（おおよそ、解凍しないで）追加し、振盪しながら37℃で一晩を成長させる。
3. 500mLのLBアンプで1:10に希釈し、1時間拡大
4. 2時間のためにIPTGを0.1mMのでGST -タンパク質の産生を誘導する。
5. 5000に遠心ボトルや遠心分離機、Sorval GSA3ローターに均等に配布するRPM 4℃で20分間。
6. 遠心ボトルにペレットを再懸濁します、溶解緩衝液10ml *
   *細菌溶解バッファー：20％ショ糖、10％グリセロール、50mMのトリスpH8.0、0.2mMののNa ₂ S ₂ O _5、2mMのMgCl _2、2mMのDTTは、新鮮なPMSF、ベンズアミド、アプロチニンおよびロイペプチンを追加。
7. 2〜3分間（これは超音波処理器の種類によって異なります。私たちは、マーク6で設定されたフィッシャーソニックDismembranatorモデル500、50％のサイクルを使用する）超音波洗浄します。
8. 遠心分離機、ソーバルSS34、4℃で20分10,000回転℃、この時点で小アリコートを取り出すことができるとSDS - PAGEによって実行されます。ゲルはクマシーで染​​色することができますし、バンドは46 kDaの明らかなはずである。
9. 上清を除去し、50％glutatione -セファロース4Bスラリーの1 mLを加える。
10. 4℃で30分間インキュベート° Cを回転した。溶解緩衝液で3回洗浄する。
11. GST -魚のバッファを使用して50％スラリー（約1ml）にGST-RBD/glutatione-Sepharoseビーズを再懸濁します** ** GST -魚のバッファ：10％グリセロール、50mMのトリスpH7.4の、100mMのNaCl、1％NP - 4、2mMのMgCl _2、新鮮なPMSF、ベンズアミド、アプロチニンおよびロイペプチンを追加する

2。 GST -融合は、アッセイをプルダウン

1. 5〜10 × 10 ⁶細胞/アッセイを使用して、
2. 一度、氷冷PBSで細胞を洗浄、氷上にプレートを保つ（我々が氷で満たされた平らなガラス皿を使用）と0.5mLのGST -魚のバッファーで溶解する。
3. 氷上で5分間インキュベートする、ラバーポリスマンやフラットスクラッパーを使用して、収穫の細胞は、チューブを遠心し、4℃で20,000 rpmの5分を遠心分離して譲渡℃に
4. 新鮮なマイクロ遠心チューブに上清を移す。合計ローを（すなわちGDP + GTP結合）を決定するために50μLを取る。
5. 0.5mLのGST-RBD/glutatione-Sepharoseビーズを追加し、4℃で回転で一晩℃で、インキュベートする。
6. GST -魚のバッファ付き6X洗います。
7. 40μL2X - Laemelliサンプルバッファーで再懸濁し、ビーズ
   この時点で2.4にかかった合計Rhoタンパク質のアリコートの濃度を測定し、30μgのは、対応するアクティベーションサンプルでゲル上で実行されるようにしておく必要があります。
8. 沸騰サンプルは90℃で5分間、軽く遠心し、上清（すなわち、ビーズを避けるために）負荷がかかると12ウェル4-20％グラジエントSDS - PAGEゲル上で実行されます。
9. ないより高い150よりボルト、Towbinバッファーを用いてメンブレンにトランスファーし、100 Wの定電流で泳動する
10. RhoC - specfic抗体と5％ミルク/ TBST液とプローブをメンブレンにブロックする。

3。代表的な結果

良い結果は約22 kDaの単一バンドを生成する必要があります。悪い結果では、複数のバンドや高いバックグラウンドを生成する。これは、タンパク質分解、サンプルの不完全な洗浄または古いGST - RBDの使用を示している。

図1。RhoC GTP加水分解酵素の異なるレベルを表現する3つの別々の細胞株は、アクティブおよび総RhoCなしRhoCのアクティブと合計RhoC、高レベルの低レベルを実証するために示されている。ブロットは、取り除かれ、合計RhoCタンパク質のためのローディングコントロールとしてハウスキーピング遺伝子のアクチンに対する抗体で再プローブした。

図2。タンパク質分解、サンプルの不完全な洗浄または古いGST - RBDの使用から複数のバンドや高いバックグラウンドの結果は。

ディスカッション

手順の最も重要なステップは、新鮮なGST - RBDの世代です。このステップに細心の注意を払うために失敗は失敗の主な理由です。すべてのステップは、細胞溶解液（2.5）で一晩インキュベーションにGST - RBD（1.2）の世代から、一日で行う必要があります。もう一つの重要なステップは、細胞ライセートを生成するために十分な細胞があることを一定にすることです。セル内の低いレベルで存在?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gluthione-sepharose 4B beads	GE Healthcare	17-0756-01
Criterion 4-20% Tris-HCl gels	Bio-Rad	345-0032