RhoC Assay Activation GTPase

Resumo

Este protocolo utiliza um pull down ensaio para determinar os níveis de GTPase RhoC ativa dentro das células.

Resumo

RhoC GTPase tem homologia de 91% para RhoA GTPase. Devido à sua prevalência nas células, muitos reagentes e técnicas para RhoA GTPase têm sido desenvolvidos. No entanto, RhoC GTPase é expressa em células de câncer metastático em níveis relativamente baixos. Por isso, poucos RhoC-reagentes específicos têm sido desenvolvidos. Nós adaptamos um ensaio de ativação Rho GTPase para detectar RhoC. Esta técnica utiliza um GST-Rho proteína de fusão de ligação de domínio para retirar GTPase RhoC ativo. Além disso, podemos colheita de proteína total no início do ensaio para determinar os níveis do total (GTP e GDP bound) GTPase RhoC. Isso permite a determinação da ativa versus total de GTPase RhoC na célula. Várias versões comerciais deste procedimento têm sido desenvolvidos no entanto, os kits comerciais são otimizados para RhoA GTPase e, normalmente, não funcionam bem para RhoC GTPase. Partes do ensaio ter sido modificado, bem como o desenvolvimento de um anticorpo específico RhoC.

Protocolo

1. Prepare proteína de fusão GST-

1. Stocks de glicerol JM109 bactérias competente, que contenha o primeiro N-terminal 90 aminoácidos da Rho rhotekin ligação de domínio (RBD) subclonado no pGEX3x BamH1/EcoR1 vector são feitas.
   
   Para garantir alta eficiência Os seguintes passos devem ser realizados para cada experimento. Em nossa experiência, preparados na hora GST-RBD é a chave para um ensaio robustas e precisas GTPase ativação.
2. Adicionar 50 mL (aproximados, não descongelar) do estoque de glicerol a 50 mL de LB ampères e crescer 37 ° C durante a noite com agitação.
3. Diluir 1:10 em 500 mL LB-amp e crescer por 1 h.
4. GST induzir a produção de proteína com 0,1 mM IPTG durante 2 horas.
5. Distribuir uniformemente em garrafas centrífuga e, centrífuga Sorval GSA3 rotor em 5000 RPM 4 ° C por 20 min.
6. Ressuspender pellet em frascos de centrífuga, 10 mL de tampão de lise *.
   * Tampão de Lise bacteriana: sacarose 20%, glicerol 10%, 50 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM Na ₂ S ₂ O _5, 2 mM MgCl _{2, 2} mM DTT, Adicionar PMSF fresco, benzamida, aprotinina e leupeptin.
7. Sonicate 2-3 min (isso depende do tipo de sonicador. Usamos um Fischer de Sonic Dismembranator Model 500 fixado em marca 6, o ciclo de 50%).
8. Centrífuga, Sorvall SS34, 20 min 10.000 rpm a 4 ° C. Neste ponto, uma pequena alíquota pode ser retirado e dirigida por SDS-PAGE. O gel pode ser manchado coomassie e uma banda deve ser aparente em 46 kDa.
9. Remover o sobrenadante e adicionar 1 mL de 50% glutation-Sepharose 4B lama.
10. Incubar por 30 min a 4 ° C com rotação. Lavar 3 vezes com tampão de lise.
11. Ressuspender contas GST-RBD/glutatione-Sepharose a uma suspensão de 50% (aproximadamente 1 mL) com GST peixe-buffer **. ** Buffer GST-Peixe: Glicerol 10%, 50 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-4, 2 mM MgCl _2, Adicionar PMSF fresco, benzamida, aprotinina e leupeptin

2. GST-fusion pull down ensaio

1. Use 50-10 x 10 ⁶ células / ensaio
2. Lave as células uma vez em PBS gelado, manter as placas de gelo (usamos um prato de vidro plano cheio de gelo) e lise com 0,5 mL de buffer GST-peixe.
3. Incubar 5 minutos em gelo, as células colheita usando um policial de borracha ou scrapper plana, transferir para tubo de microcentrífuga e centrifugar 20.000 rpm 5 min a 4 ° C.
4. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco. Tomar 50 mL para determinar Rho total (ou seja, PIB + GTP ligado).
5. Adicionar 0,5 mL contas GST-RBD/glutatione-Sepharose e incubar a 4 ° C, durante a noite com rotação.
6. Lavar 6x com GST peixe-buffer.
7. Contas ressuspender em 40 mL tampão de amostra 2x-Laemelli
   Neste ponto, a concentração da alíquota total de proteínas Rho tomadas em 2.4 devem ser determinados e 30 mg preparado para ser executado no gel com a amostra de ativação correspondente.
8. Amostras ferver a 90 ° C por 5 min, centrífuga e tomar brevemente carga (ou seja, evitar a esferas) sobrenadante e executado em um gradiente de 12% bem 20/04 SDS-PAGE gel.
9. Executar gel sem volt superior a 150, a transferência para membrana usando Towbin tampão e corrente constante de 100 W.
10. Bloco de membrana com 5% de solução de leite / TBST e sonda com RhoC specfic-anticorpo.

3. Resultados representante

Bons resultados deve produzir uma única banda de aproximadamente 22 kDa. Maus resultados produzem múltiplas bandas ou fundo de altura. Este é um indicativo de degradação protéica, lavagem incompleta de amostras ou o uso de velhos GST-RBD.

Figura 1. Três linhas separadas de células expressando diferentes níveis de RhoC GTPase são apresentados para demonstrar os baixos níveis de RhoC ativa e total, altos níveis de RhoC ativa e total ou não RhoC. O blot foi então despojado e reprobed com um anticorpo para o gene de actina casa mantendo a servir como um controle de carga para a proteína RhoC total.

Figura 2. Múltiplas bandas ou resultados do fundo de alta degradação protéica, lavagem incompleta das amostras ou o uso de velhos GST-RBD.

Discussão

A etapa mais crítica do procedimento é a geração de novos GST-RBD. Incapacidade de prestar muita atenção para esta etapa é principal razão para o fracasso. Todas as etapas, desde a geração do GST-RBD (1,2) para a incubação durante a noite com o lisado celular (2,5), deve ser feito em um único dia. Outro passo fundamental é a certeza de que existem células suficientes para produzir os lisados ​​celulares. Isto é de particular importância quando se olha para RhoC GTPase, que tende a estar presente em ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gluthione-sepharose 4B beads	GE Healthcare	17-0756-01
Criterion 4-20% Tris-HCl gels	Bio-Rad	345-0032