RhoC GTPase Активация Пробирной

Резюме

Этот протокол используется выпадающее анализ, чтобы определить уровень активной RhoC ГТФ внутри клеток.

Аннотация

RhoC GTPase имеет 91% гомологию с RhoA ГТФ. Из-за своей распространенности в клетках, многие реактивы и методики RhoA GTPase были разработаны. Тем не менее, RhoC GTPase выражается в метастатические раковые клетки при относительно низких уровнях. Таким образом, несколько RhoC-специфических реагентов были разработаны. Мы адаптировали анализа Rho активации для обнаружения RhoC ГТФ. Эта техника использует GST-связывающий белок Rho слияние домена вытащить активных GTPase RhoC. Кроме того, мы можем урожай общего белка в начале анализа для определения уровня общего (ГТФ и ВВП граница) RhoC ГТФ. Это позволяет для определения активной по сравнению с общим RhoC ГТФ в клетке. Несколько коммерческих версий этой процедуры были разработаны однако, коммерческие наборы, оптимизированные для RhoA ГТФ и, как правило, не работают хорошо для RhoC ГТФ. Части анализа были изменены, а также развитие RhoC-специфических антител.

протокол

1. Подготовка GST-синтез белка

1. Глицерин запасы JM109 компетентных бактерий содержащий первые N-терминал 90 аминокислот rhotekin Rho связывающий домен (РосБР) субклонировали BamH1/EcoR1 pGEX3x вектора сделаны.
   
   Чтобы убедиться в высокой эффективности следующие шаги должны быть выполнены для каждого эксперимента. По нашему опыту, свежеприготовленный GST-РосБР имеет ключевое значение для надежного и точного анализа активации ГТФ.
2. Добавить 50 мкл (приблизительно, не оттепель) глицерина акции до 50 мл LB усилителя и расти 37 ° С в течение ночи при встряхивании.
3. Развести 1:10 в 500 мл LB-усилителя и растут в течение 1 ч.
4. Вызвать GST-белка с 0,1 мМ IPTG течение 2 часов.
5. Распределите равномерно в центрифуге бутылок и центрифуга, Sorval GSA3 ротора при 5000 RPM 4 ° С в течение 20 мин.
6. Ресуспендируют крупинку в центрифуге бутылок, 10 мл лизирующего буфера *.
   * Бактериальный буфера Лизис: 20% сахарозы, 10% глицерин, 50 мМ Трис рН 8,0, 0,2 мМ Na ₂ S ₂ O _5, 2 мМ MgCl _2, 2 мМ DTT, добавить свежие PMSF, бензамида, апротинин и leupeptin.
7. Разрушать ультразвуком 2-3 мин (это зависит от типа sonicator. Мы используем Фишер Соник Dismembranator Модель 500 установил на отметке 6, 50% цикла).
8. Центрифуга Sorvall SS34, 20 мин 10.000 оборотов в минуту при температуре 4 ° C. На данный момент небольшое аликвоту можно вынести и управляет SDS-PAGE. Гель может быть Кумасси окрашенных и группы должно быть очевидно, на уровне 46 кДа.
9. Удалить супернатант и добавьте 1 мл 50% glutatione-сефарозой 4B суспензии.
10. Инкубировать 30 мин при 4 ° С с вращением. Промыть 3 раза лизис буфера.
11. Ресуспендируют GST-RBD/glutatione-Sepharose бисера 50% раствора (примерно 1 мл) с GST-рыба буфера **. ** GST-Рыба буфера: 10% глицерин, 50 мМ Трис рН 7,4, 100 мМ NaCl, 1% NP-4, 2 мМ MgCl _2, добавить свежие PMSF, бензамида, апротинин и leupeptin

2. GST-фьюжн выпадающем анализа

1. Используйте 5-10 х 10 ⁶ клеток / Анализ
2. Вымойте клетки один раз в ледяной PBS, держите пластины на льду (мы используем плоские блюда стакан, наполненный льдом) и лизировать с 0,5 мл GST-рыба буфера.
3. Выдержите 5 минут на льду, урожай клеток с использованием полицейский резины или плоские забияка, трансфер в микроцентрифужную трубки и центрифуги 20000 оборотов в минуту 5 минут при 4 ° C.
4. Передача супернатант в новую пробирку и отцентрифугировать. Принимать по 50 мкл для определения общего Rho (т.е. ВВП + ГТФ оценка).
5. Добавить 0,5 мл GST-RBD/glutatione-Sepharose бисером и инкубировать при температуре 4 ° С, ночью с вращением.
6. Вымойте 6x с GST-рыба буфера.
7. Ресуспендируют бусины в 40 мкл 2х-Laemelli образец буфера
   На данный момент концентрация общего белка Rho аликвоту принятых в 2,4 должны быть определены и 30 мкг подготовленные для запуска в гель с соответствующего образца активации.
8. Отварите образцов при 90 ° С в течение 5 мин, центрифуги кратко и принять супернатант (т.е. избежать бусы) загрузить и запустить на 12-и 4-20% градиент SDS-PAGE гель.
9. Выполнить гель не выше 150 вольт, трансфер в использовании мембраны Towbin буфера и постоянного тока до 100 В.
10. Блок мембраны с 5% молока / TBST решения и зонд с RhoC-specfic антител.

3. Представитель Результаты

Хорошие результаты должны производить одну полосу примерно в 22 кДа. Плохие результаты производить несколько полос или высокий фон. Это свидетельствует о деградации белка, неполное промывки образцов или использование старых GST-РосБР.

Рисунок 1. Три отдельных клеточных линий, выражающих различные уровни RhoC GTPase показаны продемонстрировать низкий уровень активной и полной RhoC, высокий уровень активной и полной RhoC или нет RhoC. Пятно было тогда раздели и reprobed с антителами к ведению домашнего хозяйства гена актина в качестве управления загрузкой для общего белка RhoC.

Рисунок 2. Несколько полос или высоких результатов фон от деградации белка, неполное промывки образцов или использование старых GST-РосБР.

Обсуждение

Наиболее критичным этапом процедуры является генерация свежих GST-РосБР. Невыполнение обратить пристальное внимание на этот шаг является основной причиной для отказа. Все шаги, от поколения GST-RBD (1.2) для инкубации в течение ночи с Клеточный лизат (2,5), должно быть сделано в течение одного ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gluthione-sepharose 4B beads	GE Healthcare	17-0756-01
Criterion 4-20% Tris-HCl gels	Bio-Rad	345-0032