制备鼠尾肌腱的生物力学和Mechanobiological研究

摘要

本文介绍了用于制备生物力学和mechanobiological研究大鼠尾腱的实验程序。表现出几个特点编制的主要步骤，开始提取，截面积的测量，清洗和加载到生物反应器室。

摘要

鼠尾腱（RTT的）是一种常见的生物模型，用于在体外研究实验在肌腱的生理和肌腱领域。与这些组织的工作是具有挑战性的，因为他们是非常脆弱的，到现在为止，没有严格详细的协议，其隔离。

面对这些挑战，我们已经制定的方法和手段，以促进操纵RTT的和控制组织的可行性，不育和完整性。本文介绍了用于准备RTT的生物力学和mechanobiological研究的实验程序。我们的工作分为四个主要步骤：提取，截面积的测量，冲洗，并加载到生物反应器室。

在每一步中，所有程序，材料和操作详细介绍，使他们可以很容易地复制。此外，制定了具体的工具是：一个操纵板用于隔离RTT的，光纤微米的位置在截面积测量和锚固系统的组织到一个生物反应器的RTT的重视。

最后，我们描述了多个测试后获得的结果，来验证我们的方法。的可行性，不育性和完整性的评估表明，我们的程序十分脆弱的组织，如鼠尾肌腱操作严格。

研究方案

任何操作之前，你必须确定要使用取决于你进行的实验和仪器在您的性格筋组。对于我们而言，腹筋选择，因为他们都较小，因而更容易操纵时，测量的截面积和装修进入生物反应器室。

请注意，所有仪器高压灭菌或用70％乙醇消毒。此外，每个工作站旁放置一个喷雾瓶，含70％乙醇消毒每次操作前实验者手套。

第1部分：提取

尾切除后，仔细地操纵其四肢，以避免损害组织。此外，保护细胞的活力，所有操作都进行了冷盐溶液。

1A）材料：

• 冷盐溶液（D - PBS）
• 碎冰
• 表面保护
• 菜板
• 个人操纵板
• 2 500毫升菜
• 2 2L玻璃菜
• 胶带
• 1镊子
• 1钳
• 1镊子站
• 1对手术剪
• 1手术刀
• 1对手术剪
  
  
  方向识别个人操纵（“P”，“近端” 图1。）

1B）工作站：

1. 摊开的表面保护和砧板放在上面。
2. 填写每两个较大的玻璃菜中途碎冰，并放置在纸张上。
3. 坚持一个磁带上的操纵板的一个角落的一块，并确定了一封信，表明近端。
4. 两个小玻璃中途菜肴和操纵板凹槽填充冷盐溶液。它们放置在含有冰的大玻璃菜。
5. 表面上保护组织的所有消毒。
6. 转移到尾部的玻璃含盐水菜之一。

1C）操作：

1. 尾部近端的解剖观察，以区别于背侧腹侧。腹侧有一个数量较大的肌腱和血管，可轻轻挤压尾部产生微小的血液滴核实。
2. 使用的手术剪，切沿尾部背侧皮肤，如果你想提取的腹筋（或沿腹端，如果您需要背筋）。
3. 打开切口近端和删除通过精心操纵尾部两端使用产钳或手指和皮肤。
4. 在盐溶液的血液和头发用清水冲洗干净，并转移到剩余的玻璃盘包含新鲜的溶液试样。更换手套。
   
   光显微镜下观察显示了一个横向的第6个肌腱组。一位来自各组肌腱是连接到每个椎体的尾部结束，因此，我们在椎间盘切揭露新的肌腱沿切割。
   
   
   图2横向光学显微镜下观看了鼠尾节。
5. 穿过软骨2-3椎体手术剪短的末端。放在砧板上的尾巴，削减使用手术刀，然后立即在解决方案取代的软组织。
6. 使用镊子，从远端尾部拉出一个肌腱。
7. 在两端的温柔举行，放入个人操纵板的肌腱​​。
   
   重复最后两个步骤，直到没有更多的筋可以梳理出切椎较短时，新的组织需要公开的。

第2部分：截面积测量⁷

当组织发生机械特性或刺激，其机械性能正常化内肌腱的力量，强调。这就是为什么我们评估的横截面面积。

2A）材料：

• 光学测微计
• 体视显微镜
• 数码相机
• 边缘识别和简介重建算法^5,6
• 冷盐溶液（D - PBS）
• 1 20 -200μL微量移液器
• 1光纤微米调整的六角扳手
• 2镊子
  
  / files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg“ALT =”图3“/>
  图3光纤千分尺。

2B）工作站：

1. 打开软件（数码相机和算法）。
2. 将光纤微米，以便有足够的空间来装载在仪器的肌腱。
3. 组织的工具和玻璃盘提取筋近在咫尺。

2C）操作：

1. 冷盐溶液填充测量车厢，直到两个锚系统被淹没。
2. 拿着镊子的两端的肌腱转移到车厢。
3. 通过微量移液器吸，拉硅管在同一时间进入一个肢体。吸，直到最后超出了固定环延伸。
4. 拧紧固定环，压缩管，并安装在立体显微镜下仪器。
5. 105X的放大倍率，同时观察组织，直到的折痕不再感知舒展筋。通过“额外的0.40％。
   
   
   图4。投影105X的放大倍率和拉伸后肌腱。
6. 调整位置和重点，以保持一个清晰的图像超过180 °旋转肌腱。
7. 以每10 °旋转的照片，无需修改紧张，焦点或位置。仅使用旋转轴进行旋转。由于它的圆锥形，这些步骤可能会重复沿肌腱的不同点。
8. 激活边缘识别和轮廓重建算法，以分析您已注册的数据库。
9. 免费肌腱松开固定环和使用的硅微量移液器管空气吹。
10. 重新插入到操纵板肌腱，再处理完。
11. 验证取得的个人资料重建和横截面积的价值的形状。

第3部分：清洗

要删除以前的操作过程中可能发生的污染，组织生物安全柜下冲洗。

3A）材料：

• 冷盐溶液（D - PBS）
• 多槽操纵板
• 个人操作板
• 胶带
• 2镊子
• 1镊子站

3B）工作站：

1. 提前打开风扇在生物安全柜15分钟和清洁的内表面用70％乙醇。
2. 带内的生物安全柜中的所有文书。
3. 坚持到一个角落的每一个人板件的磁带，以确定近端。
4. 用无菌生理盐水溶液填充凹槽。

3C）操作：

1. 介绍操纵板，包含在内阁中提取肌腱。
2. 使用镊子，取出其板块的把握上，每年年底的温柔的肌腱。
3. 沉浸和多槽操纵板的每个车厢的盐溶液中轻轻搅动，肌腱，从最近开始，出发到最远的凹槽。
4. 最后，淹没在一个单独的操纵板肌腱。

第4部分：载入到生物反应器室

为了避免进一步污染，以下操作都是在生物安全柜中进行。

4A）材料：

• 生物反应器室⁴
• 无菌锚
• 1无菌培养皿
• 冷战细胞培养培养基（DMEM）
• 瞬干胶
• 2镊子
• 镊子立场
• 0.5 -10μL微量移液器
• 1标尺
  
  
  生物反应器腔图5。

4B）工作站：

1. 由于在生物安全柜，也实现了上一步，删除不必要的工具会给你更多的工作空间。
2. 使机柜内的所有其他文书。

4C）操作：

1. 操纵盘集中在肌腱下肢和伤口组织其阀芯阀芯周围放置在一个锚。
2. 卷锚，并保持宽松的肢体，同时确保组织保持锚。 ¾转动后停止。
3. 进行相同与另一端的步骤。
4. 翻转同样两个锚，直到有6厘米之间的^中心 1 。
5. 松开肌腱沉浸在解决方案，并允许挂靠部分简要干，以提高其机械性能^2-3。
6. 倾入培养皿氰基丙烯酸酯，并绘制成的微量移液器2.5μL。
7. 在盐溶液中滴加任何胶水适用无伤口组织的氰基丙烯酸酯的下降。重复，直到2滴已应用到每个锚。
8. 随着肌腱仍然完全浸入，等待5分钟胶水完全干燥。
9. 在这段时间里，装满盐水的腔室。
10. 所有组织补充水分与盐溶液，以防止损坏。
11. 通过操纵只锚，转移到生物反应器室的肌腱和关闭，以防止在传输过程中的泄漏和污染。

第5部分：代表性的成果：

该协议的结果显示，当正确执行，我们的组织严密的隔离和编制程序，使人们有可能保持组织的不育性，可行性和完整性。

首先，使用简单，重复提取方法，我们能够提取不破坏的胶原蛋白网络，因为它可以由H＆E染色后提取意识到污染的部分微观分析观察的尾部筋。

图6。提取后肌腱的胶原蛋白网络（5μm的纵切面与H＆E染色） 。

然后，我们培养长达10天，并进行无菌测试的筋。每一天，我们镀使用琼脂培养液，孵育24小时。由于无细菌生长观察，我们得出的结论，我们的操作不会造成污染。

随着文件重建算法和光纤微米，我们能够估计在一个错误⁷ 2％的保证金的横截面积。

图7。个人资料重建的RTT。

最后，我们评估使用后冲洗的步骤，并经过12天的文化时期的哺乳动物细胞的活/死可行性/细胞毒性试剂盒的可行性。由于绿色荧光活细胞大部分是很明显的的，我们可以证实，我们的隔离程序，成功地保持活组织。同样的测试，安装好后，进入生物反应器室的肌腱进行了两个小时。我们核实，脱水和胶锚没有在两个锚之间的组织传播。

图8。组织在锚可行性（绿色=活细胞，红色=死细胞）

讨论

通过应用这些实验程序，我们可以进行这样的组织在体外研究了多种。例如，组织变性的研究进行了为期10天的RTT的刺激下的应用程序。每一天，我们评估组织的力学性能，在非破坏性应力松弛试验。最后，我们能够观察到的RTT的应力变化，从而分析力学性能的进展。

图9。内河码头的应力变化评估槽松弛?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-PBS	Reagent	Wisent Inc.	311-410-CL	Saline solution
Glucose	Reagent	Wisent Inc.	609-037-EL	Saline solution 1g/L
Antibiotics-antimycotics	Reagent	Invitrogen	15240-062	Saline solution 1%
DMEM	Reagent	Invitrogen	12800-017	Culture solution
Sodium Bicarbonate	Reagent	Wisent Inc.	600-105-CG	Culture solution 3.7g/L
FBS	Reagent	Wisent Inc.	090150	Culture solution 10%
Antibiotics-antimycotics	Reagent	Invitrogen	15240-062	Culture solution 1%
Optic Micrometer	Tool	Custom Made
Manipulation plate	Tool	Custom Made
Bioreactor chamber	Tool	Custom Made