הכנת הגידים זנב עכברוש ללימודי biomechanical ו Mechanobiological

Summary

מאמר זה מתאר את הפרוצדורות המשמשים להכנת זנב גידים עכברוש ללימודי biomechanical ו mechanobiological. מספר תכונות של שלבים עיקריים בהכנת הם הפגינו, עם תחילת החילוץ, חתך מדידת שטח, שטיפה וטעינה החדרה bioreactor.

Abstract

זנב עכברוש גידים (RTTs) הם מודל ביולוגי נפוץ בשימוש ניסיוני במבחנה בתחומי הפיזיולוגיה tendinopathy הגיד. עבודה עם רקמות אלה הוא מאתגר כי הם שבירים מאוד, עד עכשיו לא היה פרוטוקול מפורט בקפדנות על הבידוד שלהם.

כדי להתמודד עם האתגרים הללו, פיתחנו שיטות וכלים כדי להקל על מניפולציה של RTTs ורקמות לשלוט הכדאיות, עקרות ויושרה. מאמר זה מתאר את הפרוצדורות המשמשים להכנת RTTs ללימודי biomechanical ו mechanobiological. העבודה שלנו מחולק לארבעה שלבים עיקריים: מיצוי, חתך מדידת שטח, שטיפה וטעינה החדרה bioreactor.

בכל שלב, כל הנהלים, חומרים מניפולציות מוצגים בפירוט, כך שהם יכולים לשכפל בקלות. יתר על כן, המכשירים ספציפית שפותחה מוצגים: צלחת מניפולציה בשימוש להפריד RTTs, מיקרומטר אופטיים לתפקיד רקמות במהלך המדידה חתך את האזור מערכת עיגון לצרף את RTTs על bioreactor.

לבסוף, אנו מתארים את התוצאות שהתקבלו לאחר בדיקות מרובות כדי לאמת את השיטות שלנו. הערכות כדאיות, עקרות ויושרה להוכיח כי הנהלים שלנו קפדנית דיה מניפולציות של רקמות שביר כגון גידים זנב חולדה.

Protocol

לפני מניפולציה כלשהי, עליך לזהות את קבוצת גידים לשמש תלוי בניסוי שבו אתה מנהל את המנגנון על מזגו של האדם. לענייננו, גידים הגחון נבחרו משום שהם קטנים יותר, ולכן קל יותר לתמרן, כאשר מדידת שטח חתך והתאמת אותם לתוך תא bioreactor.

שים לב כי כל המכשירים הם autoclaved או מעוקר עם אתנול 70%. יתר על כן, בקבוק ספריי המכיל 70% אתנול ממוקם ליד כל תחנת עבודה לעקר את הכפפות הנסיינים לפני כל פעולה.

חלק 1: Extraction

לאחר כריתה, הזנב הוא מניפולציה בקפידה על ידי הגפיים שלו, כדי למנוע נזק לרקמות. כמו כן, כדי לשמר את כדאיות התא, כל המניפולציות מתבצעות תמיסת מלח קרים.

1A) חומרים:

• תמיסת מלח הקרה (D-PBS)
• קרח כתוש
• משטח מגן
• קרש חיתוך
• מניפולציה צלחות אישיות
• 2 מנות 500 מ"ל
• 2 צלחות זכוכית 2L
• סרט דבק
• 1 מלקטת
• 1 מלקחיים
• 1 מלקטת לעמוד
• 1 זוג מספריים כירורגיות
• 1 איזמל
• 1 זוג מספריים כירורגיות
  
  
  באיור 1. מניפולציה הפרט להזדהות עם אוריינטציה ("P" עבור "בקרבה")

1B) תחנת עבודה:

1. מורחים את פני מגן והמקום קרש חיתוך על העליונה.
2. ממלאים כל שתי מנות זכוכית גדול יותר באמצע הדרך עם קרח כתוש ומניחים אותם על הנייר.
3. סטיק חתיכת סרט בפינת הצלחת מניפולציה להזדהות עם מכתב כדי לציין את סוף הפרוקסימלי.
4. מלאו את שתי מנות כוס קטנה באמצע וכל החריצים של צלחות מניפולציה עם תמיסת מלח קרים. הנח להם את הכלים זכוכית גדולים המכילים קרח.
5. ארגן את כל המכשירים סטרילי מגן על פני השטח.
6. מעבירים את הזנב לתוך אחד צלחת זכוכית המכילה תמיסת מלח.

1C) מניפולציות:

1. שים את האנטומיה בסוף הפרוקסימלי של הזנב כדי להבדיל בין הצד הגחוני מהצד הגבי. הצד הגחוני יש מספר גדול יותר של גידים וכלי דם כי יכול להיות מאומת על ידי לוחץ בעדינות את הזנב כדי לייצר טיפות דם זעירות.
2. בעזרת מספריים כירורגיות, לחתוך את העור בצד הגבי של הזנב ואם אתה רוצה לחלץ את הגידים הגחוני (או בצד הגחון אם אתה צריך הגידים הגבי).
3. פתח את החתך בקצה הפרוקסימלי ולהסיר את העור באמצעות מלקחיים או האצבעות על ידי מניפולציה בזהירות את קצות הזנב.
4. לשטוף את הדם שיער בפתרון מלוחים ולהעביר את הדגימה לתוך צלחת הזכוכית שנותרו המכיל פתרון טריים. שנה כפפות.
   
   קטע משוכל שנצפו תחת מיקרוסקופ אור מראה את הקבוצות גיד שש. גיד אחד מכל קבוצה מחוברת בקצה הזנב של כל חוליה, ולכן אנו לגזור על דיסק חולייתי לחשוף גידים חדשים לאורך החתך.
   
   
   איור 2. סעיף משוכל של הזנב חולדה שנצפו תחת מיקרוסקופ אור.
5. חותכים את הקצה הדיסטלי באמצעות חוליות סחוס 2-3 קצרה עם המזמרה כירורגית. מניחים את הזנב על קרש החיתוך כדי לחתוך את הרקמות הרכות באמצעות אזמל ומיד להחליף אותו בפתרון.
6. בעזרת פינצטה, שולף אחת גיד מקצה הזנב דיסטלי.
7. עם להחזיק עדין בשני קצותיו, המקום גיד לתוך הצלחת מניפולציה בודדים.
   
   חזור על שני הצעדים האחרונים, עד הגידים לא יכול להיות יותר התגרו החוצה חתך אחד חוליה קצר בכל פעם רקמות חדש צריך להיות חשוף.

חלק 2: חתך מדידת שטח ⁷

כאשר רקמת עובר גירוי מכני או אפיון, תכונות מכניות שלה מתוארים על ידי נרמול הכוח בתוך הגיד ללחץ. זו הסיבה מדוע אנו מעריכים חתך באזור.

2A) חומרים:

• אופטיק מיקרומטר
• Stereomicroscope
• מצלמה דיגיטלית
• אדג' הכרה ושיקום פרופיל אלגוריתמים ^5,6
• תמיסת מלח הקרה (D-PBS)
• 1 20 200μL מיקרו פיפטה נפח
• 1 Hex מפתח עבור התאמות מיקרומטר אופטיים
• 2 מלקטת
  
  / Files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg "alt =" איור 3 "/>
  איור 3. מיקרומטר אופטיק

2B) תחנת עבודה:

1. פתח את התוכנה (מצלמה דיגיטלית ואלגוריתמים).
2. מניחים את מיקרומטר אופטיים, כך שיש מספיק מקום כדי לטעון את גיד במנגנון.
3. ארגן את המכשירים צלחת זכוכית המכיל את הגידים חילוץ בהישג יד.

2C) מניפולציות:

1. מלאו את תא המדידה עם תמיסת מלח קרים עד שתי מערכות עוגן שקועות.
2. מעבירים את הגיד לתוך התא על ידי החזקת מסתיים עם פינצטה.
3. באמצעות שאיבה באמצעות פיפטה מיקרו נפח, במשיכה אחת הגפיים בכל פעם לתוך הצינור סיליקון. לשאוב עד סוף חורג קולרים פיר.
4. הדקו את הקולרים פיר כדי לדחוס את צינורות להתקין את המנגנון תחת stereomicroscope.
5. בהגדלה 105X, למתוח את הגידים תוך שמירה על הרקמה עד קמטים הם כבר לא מורגש. מתיחה של 0.40% נוספים.
   
   
   איור 4. הקרנת גיד בהגדלה 105x לפני ואחרי מתיחה.
6. התאמת המיקום להתמקד כדי לשמור על תמונה ברורה של הגיד על סיבוב 180 מעלות.
7. קח תמונה בכל סיבוב כל 10 ° ללא שינוי, מתח להתמקד או עמדה. השתמש רק פיר רוטרי לבצע את הסיבוב. בשל צורת חרוט שלה, צעדים אלה ניתן לחזור בנקודות שונות לאורך הגיד.
8. הפעל את ההכרה קצה ושיקום אלגוריתמים פרופיל על מנת לנתח את הנתונים נרשמת.
9. חינם את הגיד על ידי שחרור קולרים פיר ונושף אוויר לתוך צינורות סיליקון בעזרת פיפטה נפח מיקרו.
10. הכנס מחדש את גיד לצלחת מניפולציה, שוב על ידי טיפול זה מסתיים.
11. בדוק את צורת השיקום פרופיל לקבל את הערך של שטח חתך.

חלק 3: שטיפה

כדי להסיר זיהום, אשר ייתכן שאירעו במהלך מניפולציות קודמות, רקמות הם שטופים תחת biosafety הממשלה.

3A) חומרים:

• תמיסת מלח הקרה (D-PBS)
• Multiple-Groove מניפולציה צלחת
• מניפולציה צלחות אישיות
• סרט דבק
• 2 מלקטת
• 1 מלקטת לעמוד

3B) תחנת עבודה:

1. הפעילו את המאוורר בתוך הקבינט biosafety 15 דקות מראש לנקות את המשטח הפנימי עם אתנול 70%.
2. תביאו את כל הכלים בתוך הארון biosafety.
3. סטיק פיסות סרט על בפינה של כל צלחת אישית כדי לזהות את קצה פרוקסימלי.
4. מלאו את כל החריצים עם תמיסת מלח סטרילית.

3C) מניפולציות:

1. הציגו את הצלחת מניפולציה המכיל את גיד חילוץ בממשלה.
2. בעזרת פינצטה, להסיר את גיד מהצלחת שלה עם לתפוס עדין בכל צד.
3. לטבול ומערבבים בעדינות את הגיד בפתרון מלוחים של תא אחד צלחת מרובות החריץ מניפולציה, החל הקרוב ביותר ומתחילה חריץ הרחוק.
4. לבסוף, להטביע את גיד בצלחת מניפולציה בודדים.

חלק 4: טוען לתוך תא bioreactor

כדי למנוע זיהום נוסף, מניפולציות הבא נערכים גם בממשלה biosafety.

4A) חומרים:

• Bioreactor תא ⁴
• סטרילי עוגנים
• 1 צלחת פטרי סטרילית
• תא בינוני הקרה תרבותי (DMEM)
• Cyanoacrylate
• 2 מלקטת
• מלקטת לעמוד
• 0.5-10μl Micro בנפח פיפטה
• 1 שליט
  
  
  איור 5. Bioreactor קאמרית

4B) תחנת עבודה:

1. מאז השלב הקודם התממשה גם biosafety הממשלה, הסרת כלים מיותרים ייתן לך מרחב עבודה יותר.
2. תביאו את כל מכשירים אחרים בתוך הממשלה.

4C) מניפולציות:

1. המקום עוגן על הצלחת מניפולציה עם סליל שלה מרוכז על הגפיים הגיד והפצע רקמות מעלה סביב סליל.
2. מרדדים את העוגן על והחזק את הגפיים משוחרר תוך הקפדה כי רקמת נשארת מחוברת אל העוגן. עצור לאחר ¾ לפנות.
3. לבצע את אותו הדברעם צעדים בצד השני.
4. מרדדים שני עוגנים על פחות עד שיהיה 6 ס"מ בין מרכזי שלהם ^1.
5. שחרר את גיד לטבול אותו פתרון ולאפשר את הסעיפים מעוגנים יבשה לזמן קצר על מנת לשפר תכונות מכניות שלה ^2-3.
6. יוצקים cyanoacrylate לתוך צלחת פטרי ולהסיק 2.5μL לתוך פיפטה נפח מיקרו.
7. החל ירידה של cyanoacrylate לרקמות בפצע, מבלי להפיל את כל דבק בפתרון מלוחים. חזור על הפעולה עד 2 טיפות הוחלו על כל עוגן.
8. עם גיד עדיין שקוע לגמרי, לחכות 5 דקות הדבק להתייבש לחלוטין.
9. במהלך תקופה זו, למלא את תא קאמרית עם תמיסת מלח.
10. רעננותם כל רקמה עם תמיסת מלח כדי למנוע נזק.
11. על ידי מניפולציה רק ​​עוגנים, העברת גיד החדרה bioreactor ולסגור אותה כדי למנוע דליפה וזיהום במהלך ההעברה.

חלק 5: תוצאות נציג:

התוצאה של הפרוטוקול מלמדת כי כאשר היא מבוצעת כהלכה, בידוד קפדני רקמה שלנו הליך הכנת לעשות את זה אפשרי כדי לשמור על סטריליות רקמות, הכדאיות ויושרה.

ראשית, בשיטת החילוץ פשוט חוזרות ונשנות, אנו מסוגלים לחלץ גידים הזנב מבלי לפגוע ברשת הקולגן כפי שהוא יכול להיות שנצפו על ידי ניתוח מיקרוסקופי של חלקים H & E נגועה הבין לאחר החילוץ.

איור 6. רשת קולגן גיד לאחר החילוץ (5μm סעיף האורך מוכתם H & E).

לאחר מכן, אנו גידים בתרבית עד עשרה ימים בדיקות שנערכו עקרות. כל יום, אנחנו תרבות מצופה פתרון בשימוש אגר ו מודגרות זה למשך 24 שעות. מאז לא נצפתה התפתחות חיידקים, הגענו למסקנה כי מניפולציות שלנו לא לגרום לזיהום.

עם האלגוריתם פרופיל שיקום מיקרומטר אופטיים, אנו מסוגלים להעריך את שטח חתך בתוך בהפרש של 2% שגיאה ^7.

איור 7. מחדש פרופיל של RTT.

לבסוף, אנו להעריך כדאיות השימוש LIVE / מת ליכולת הקיום / cytotoxicity Kit עבור בתאי יונקים לאחר שלב שטיפה לאחר תקופת שנים עשר יום תרבות. מאז רוב גדול של תאים חיים ירוק ניאון ניכרו, אנו יכולים לאשר כי הליכי הבידוד שלנו מצליחים לשמר רקמת חיים. הבדיקה בוצעה אותו שעתיים אחרי מצרף את הגיד לתוך תא bioreactor. אנו אומת כי התייבשות דבק בו עוגן לא התפשט ברקמות בין שני עוגנים.

איור 8. הכדאיות רקמות על העוגן (ירוק = תאים חיים, אדום = תאים מתים)

Discussion

על ידי יישום אותן הפרוצדורות, אנחנו יכולים לנהל מגוון רחב של במבחנה על סוג זה של רקמות. כמו למשל, מחקר על ניוון הרקמה בוצע על ידי יישום של גירוי מתחת ל RTTs לתקופה של עשרה ימים. כל יום, הערכנו תכונות הרקמה מכני שאינו הרסני בדיקות הרפיה מתח. בסוף, הצלחנו לשמור וריאציה מ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-PBS	Reagent	Wisent Inc.	311-410-CL	Saline solution
Glucose	Reagent	Wisent Inc.	609-037-EL	Saline solution 1g/L
Antibiotics-antimycotics	Reagent	Invitrogen	15240-062	Saline solution 1%
DMEM	Reagent	Invitrogen	12800-017	Culture solution
Sodium Bicarbonate	Reagent	Wisent Inc.	600-105-CG	Culture solution 3.7g/L
FBS	Reagent	Wisent Inc.	090150	Culture solution 10%
Antibiotics-antimycotics	Reagent	Invitrogen	15240-062	Culture solution 1%
Optic Micrometer	Tool	Custom Made
Manipulation plate	Tool	Custom Made
Bioreactor chamber	Tool	Custom Made