患者组织及基因传递考试前的体外培养

摘要

本文介绍了文化基因传递研究和基因表达的后续分析使用IVIS生物发光成像的患者的组织切片。

摘要

本视频介绍了病人组织，利用体外基因传递的研究模型。新鲜病人在手术时获得的组织切片和保持文化。 体外模型系统可以完整的病人组织和使用IVIS检测系统通过生物 ​​发光成像分析基因表达的基因进入实物交割。发光检测系统演示，而不需要为组织牺牲在个别切片基因表达的快速，准确的量化。这片组织文化系统可用于多种组织类型，包括正常的和恶性的组织，并允许我们研究的异质性和完整的组织，个别患者之间的变异程度高的影响。这个模型系统可用于在某些情况下，作为动物模型的替代性和互补的临床前模式进入临床试验之前。

研究方案

媒体和试剂的制备

1. 抗生素溶液
   磷酸盐缓冲液（PBS 200 U / ml青霉素，200μg/ mL链霉素，5微克/毫升fungizone）
2. 收集和处理介质
   贝科的改良Eagle培养基（DMEM）200 U / ml青霉素，200μg/ mL链霉素，5微克/毫升fungizone
3. 培养基
   收集培养基中含有10％热灭活胎牛血清

一，组织收集和储存

病人组织收集科克教学医院的临床研究伦理委员会，并获得批准的是从患者手术前一天获得的知情同意。接受部分切除恶性疾病的患者肝组织。

1. 在手术切除时获得新鲜的病人组织。
2. 组织是在收集媒体储存在4 ° C冷藏（组织可以存储高达12 h无生存能力的重大损失，但是立即处理建议）。

二。组织切片的制备及文化

切片使用vibratome（徕卡，德国）。组织切片系统是根据制造商的说明使用。组织切片准备进行下一个无菌罩使用70％2 - 丙醇清洗工具。层厚设定为2000微米，并削减在22-26 RPM使用往复式刀片。

1. 组织是在抗生素溶液冲洗三次。
2. 组织是连接到安装阶段使用无毒胶粘剂（Dermabond）。
3. 层厚切片是在22-26 RPM实现。
4. 片保持在6孔培养皿中（每孔片）在培养基在37℃，5％CO ₂饱和湿度环境中。

三。基因传递到组织切片

1. 片是预先在37 ° C 2 H事先治疗。
2. 培养液是治疗介质取代。
3. 切片直接注射病毒载体（25μL病毒颗粒Ad5.CMVluc [1 × 10 ^9]）。另外，粒子可能被添加到中等，被动输液。
4. 经过两个小时的潜伏期，血清添加到中等。

四。发光分析基因表达分析

1. 片注入100μL荧光素底物（3毫克/毫升）。
2. 6孔培养皿放在舞台上，孵育10 min。
3. 切片成像灵敏度高（图1）5分钟。

五，代表性的成果

图1。使用IVIS检测系统对患者肝片的生物发光成像。

讨论

我们描述了一个前患者体内的组织培养方法和生物发光检测系统交付非固定的人体组织内的基因进行评估。该方法提供了一个简单，重复性的方式，培养组织切片。它有很大的潜力，因为它允许成各种人体组织，其中包括恶性组织成完整的人体组织的基因传递的研究，基因传递的分析和关于尊重个人的患者之间的变异程度高的影响，可以提供重要的信息基因的吸收。成功的转基因表?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Firefly Luciferin	Biosynth International, Inc
Dermabond	Johnson & Johnson
Vibrotome	Leica Microsystems	VT 1000 A