Ex Cultura Vivo de tecido do paciente e Exame de Entrega Gene

Resumo

Este artigo descreve a cultura de fatias de tecido de pacientes para estudos de genes de entrega e análise de expressão gênica utilizando IVIS imagem de bioluminescência.

Resumo

Este vídeo descreve o uso de tecido do paciente como um modelo ex vivo para o estudo da entrega do gene. Tecido do paciente fresca obtida no momento da cirurgia é cortado e mantidas em cultura. O sistema modelo ex vivo permite a entrega física de genes em tecidos de pacientes intactos e expressão do gene é analisado por imagem de bioluminescência usando o sistema de detecção de IVIS. O sistema de detecção bioluminescentes demonstra quantificação rápida e precisa da expressão do gene dentro fatias individuais sem a necessidade de sacrificar tecido. Esta fatia do sistema de cultura de tecidos pode ser utilizado em uma variedade de tipos de tecidos, incluindo o tecido normal e maligno e nos permite estudar os efeitos da heterogeneidade do tecido intacto e do alto grau de variabilidade entre pacientes individuais. Este modelo de sistema poderia ser usado em determinadas situações como uma alternativa aos modelos animais e como um modo de pré-clínicos complementares antes de entrar em teste clínico.

Protocolo

Preparação de Mídia e Reagentes

1. Solução de antibióticos
   Tampão fosfato salino (PBS) com 200 U / ml de penicilina, estreptomicina 200 mg / ml, 5 mg / ml Fungizone
2. Média de coleta e tratamento
   Dulbecco modificado da águia (DMEM) com 200 U / ml de penicilina, estreptomicina 200 mg / ml, 5 mg / ml Fungizone
3. Meio de cultura
   Médio coleção contendo 10% inativado pelo calor soro fetal bovino

I. coleção de tecidos e de armazenamento

Aprovação para a coleta do tecido do paciente foi obtida a partir da Clínica de Ética em Pesquisa dos Hospitais de Ensino Cork e consentimento informado foi obtido dos pacientes na véspera da cirurgia. Tecido hepático foi obtido de pacientes submetidos a hepatectomia parcial de doença maligna.

1. Tecido fresco paciente é obtido no momento da ressecção cirúrgica.
2. Tecido é armazenado nos meios de comunicação coleta a 4 ° C (tecido podem ser armazenadas sob refrigeração por até 12 h sem perda significativa de viabilidade, no entanto processamento imediato é recomendado).

II. Preparação do tecido fatia e cultura

Corte foi realizado utilizando um vibratome (Leica, Alemanha). O sistema de corte de tecido foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Preparação fatia de tecido foi realizada sob um capuz estéreis, utilizando instrumentos limpos com 70% 2-propanol. Espessura de corte é de 2.000 microns e cortados com uma lâmina alternativo em 22-26 rpm.

1. Tecido é lavado em solução antibiótica três vezes.
2. Tecido está ligado à fase de montagem usando non-toxic adesiva (Dermabond).
3. Espessura de corte é definida e corte é realizado a 22-26 rpm.
4. Fatias são mantidas em meio de cultura em placas de 6 poços de cultura (uma fatia por poço) a 37 ° C com 5% de CO ₂ em um ambiente umidificado.

III. A entrega do gene em fatias de tecido

1. Fatias são pré-incubadas a 37 ° C por 2 h antes do tratamento.
2. Meio de cultura é substituído por meio de tratamento.
3. Fatias são diretamente injetados com o vetor (25 mL de partículas virais Ad5.CMVluc [1x10 ^9]). Viral Alternativamente, as partículas podem ser adicionadas ao meio, para perfusão passiva.
4. Após duas horas de incubação, o soro é adicionado ao meio.

IV. Análise de expressão gênica por análise bioluminescentes

1. Fatias são injetados com 100 ul de substrato luciferina (3 mg / ml).
2. 6-bem placa de cultura é colocada no palco e incubados por 10 min.
3. Fatias são gravadas por 5 min a alta sensibilidade (Figura 1).

Representante Resultados V.

Figura 1. Bioluminescent imagem de fatias de fígado de pacientes, utilizando IVIS sistema de detecção.

Discussão

Nós descrevemos um paciente vivo ex método de cultura de tecidos e sistema de detecção de bioluminescentes para a avaliação de entrega de genes no interior não fixa o tecido humano. O método oferece uma maneira simples e reprodutível de fatias de tecido de cultura. Ele tem um potencial significativo, pois permite o estudo da entrega do gene no tecido humano intacto, a análise da prestação de gene em uma variedade de tecidos humanos, incluindo tecido maligno e pode fornecer informações importantes ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Firefly Luciferin	Biosynth International, Inc
Dermabond	Johnson & Johnson
Vibrotome	Leica Microsystems	VT 1000 A