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Resumo

Este artigo descreve a cultura de fatias de tecido de pacientes para estudos de genes de entrega e análise de expressão gênica utilizando IVIS imagem de bioluminescência.

Resumo

Este vídeo descreve o uso de tecido do paciente como um modelo ex vivo para o estudo da entrega do gene. Tecido do paciente fresca obtida no momento da cirurgia é cortado e mantidas em cultura. O sistema modelo ex vivo permite a entrega física de genes em tecidos de pacientes intactos e expressão do gene é analisado por imagem de bioluminescência usando o sistema de detecção de IVIS. O sistema de detecção bioluminescentes demonstra quantificação rápida e precisa da expressão do gene dentro fatias individuais sem a necessidade de sacrificar tecido. Esta fatia do sistema de cultura de tecidos pode ser utilizado em uma variedade de tipos de tecidos, incluindo o tecido normal e maligno e nos permite estudar os efeitos da heterogeneidade do tecido intacto e do alto grau de variabilidade entre pacientes individuais. Este modelo de sistema poderia ser usado em determinadas situações como uma alternativa aos modelos animais e como um modo de pré-clínicos complementares antes de entrar em teste clínico.

Protocolo

Preparação de Mídia e Reagentes

  1. Solução de antibióticos
    Tampão fosfato salino (PBS) com 200 U / ml de penicilina, estreptomicina 200 mg / ml, 5 mg / ml Fungizone
  2. Média de coleta e tratamento
    Dulbecco modificado da águia (DMEM) com 200 U / ml de penicilina, estreptomicina 200 mg / ml, 5 mg / ml Fungizone
  3. Meio de cultura
    Médio coleção contendo 10% inativado pelo calor soro fetal bovino

I. coleção de tecidos e de armazenamento

Aprovação para a coleta do tecido do paciente foi obtida a partir da Clínica de Ética em Pesquisa dos Hospitais de Ensino Cork e consentimento informado foi obtido dos pacientes na véspera da cirurgia. Tecido hepático foi obtido de pacientes submetidos a hepatectomia parcial de doença maligna.

  1. Tecido fresco paciente é obtido no momento da ressecção cirúrgica.
  2. Tecido é armazenado nos meios de comunicação coleta a 4 ° C (tecido podem ser armazenadas sob refrigeração por até 12 h sem perda significativa de viabilidade, no entanto processamento imediato é recomendado).

II. Preparação do tecido fatia e cultura

Corte foi realizado utilizando um vibratome (Leica, Alemanha). O sistema de corte de tecido foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Preparação fatia de tecido foi realizada sob um capuz estéreis, utilizando instrumentos limpos com 70% 2-propanol. Espessura de corte é de 2.000 microns e cortados com uma lâmina alternativo em 22-26 rpm.

  1. Tecido é lavado em solução antibiótica três vezes.
  2. Tecido está ligado à fase de montagem usando non-toxic adesiva (Dermabond).
  3. Espessura de corte é definida e corte é realizado a 22-26 rpm.
  4. Fatias são mantidas em meio de cultura em placas de 6 poços de cultura (uma fatia por poço) a 37 ° C com 5% de CO 2 em um ambiente umidificado.

III. A entrega do gene em fatias de tecido

  1. Fatias são pré-incubadas a 37 ° C por 2 h antes do tratamento.
  2. Meio de cultura é substituído por meio de tratamento.
  3. Fatias são diretamente injetados com o vetor (25 mL de partículas virais Ad5.CMVluc [1x10 9]). Viral Alternativamente, as partículas podem ser adicionadas ao meio, para perfusão passiva.
  4. Após duas horas de incubação, o soro é adicionado ao meio.

IV. Análise de expressão gênica por análise bioluminescentes

  1. Fatias são injetados com 100 ul de substrato luciferina (3 mg / ml).
  2. 6-bem placa de cultura é colocada no palco e incubados por 10 min.
  3. Fatias são gravadas por 5 min a alta sensibilidade (Figura 1).

Representante Resultados V.

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Figura 1. Bioluminescent imagem de fatias de fígado de pacientes, utilizando IVIS sistema de detecção.

Discussão

Nós descrevemos um paciente vivo ex método de cultura de tecidos e sistema de detecção de bioluminescentes para a avaliação de entrega de genes no interior não fixa o tecido humano. O método oferece uma maneira simples e reprodutível de fatias de tecido de cultura. Ele tem um potencial significativo, pois permite o estudo da entrega do gene no tecido humano intacto, a análise da prestação de gene em uma variedade de tecidos humanos, incluindo tecido maligno e pode fornecer informações importantes ...

Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado através da Enfermaria Cork South Victoria University Hospital fundo do peito, a Sociedade do Câncer irlandês (CRI07TAN) e do Centro de Cork Cancer Research. Replicação incompetentes recombinante Adenovírus 5 partículas sob o controle transcricional do promotor CMV foi um presente amável do Prof Andrew Baker, da Universidade de Glasgow.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMSigma-AldrichD6429
PBSSigma-AldrichD8537
Firefly LuciferinBiosynth International, Inc
DermabondJohnson & Johnson
VibrotomeLeica MicrosystemsVT 1000 A

Referências

  1. van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Draaisma, A. L., Merema, M. T., Bezuijen, J. I., van Gils, M. J. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicol Sci. 85, 632-638 (2005).
  2. Speirs, V., Green, A. R., Walton, D. S., Kerin, M. J., Fox, J. N., Carleton, P. J. Short-term primary culture of epithelial cells derived from human breast tumours. Br J Cancer. 78, 1421-1429 (1998).
  3. Kirby, T. O., Rivera, A., Rein, D., Wang, M., Ulasov, I., Breidenbach, M. A novel ex vivo model system for evaluation of conditionally replicative adenoviruses therapeutic efficacy and toxicity. Clin Cancer Res. 10, 8697-8703 (2004).
  4. Josserand, V., Texier-Nogues, I., Huber, P., Favrot, M. C., Coll, J. L. Non-invasive in vivo optical imaging of the lacZ and luc gene expression in mice. Gene Ther. 14, 1587-1593 (2007).

Reimpressões e Permissões

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