Hasta Doku ve Gen Teslimat Sınav Ex Vivo Kültür

Özet

Bu makale, gen teslimat çalışmaları ve IVIS biyoparlaklık görüntüleme kullanarak gen ekspresyonu sonraki analiz için hasta doku dilim kültür açıklar.

Özet

Bu video ex vivo gen teslim çalışması için bir model olarak hasta doku kullanımı anlatılmaktadır. Taze hasta doku cerrahi sırasında elde dilimlenmiş ve kültür tutulur. Ex vivo model sistem sağlam hasta doku ve gen ekspresyonu biyoparlaklık görüntüleme IVIS algılama sistemi kullanılarak analiz genlerin fiziksel teslimat için sağlar. Bioluminescent algılama sistemi doku kurban için ihtiyaç olmadan hızlı ve doğru tek tek dilimler içinde gen ekspresyonu kantifikasyon göstermektedir. Bu dilim doku kültürü sistemi normal ve malign doku da dahil olmak üzere çeşitli doku tiplerinin kullanılan ve bize sağlam doku heterojen doğası ve yüksek derecede bireysel hastalar arasında değişkenlik etkilerini incelemek sağlar. Bu model sistemi ve klinik araştırmaya girmeden önce bir tamamlayıcı preklinik modu olarak hayvan modellerinde bir alternatif olarak bazı durumlarda kullanılabilir.

Protokol

Medya ve Reaktifler hazırlanması

1. Antibiyotik Çözüm
   Fosfat tamponlu salin (PBS) 200 U / ml penisilin, 200 mcg / ml streptomisin, 5 mg / ml fungizone
2. Toplama ve Arıtma orta
   Dulbecco'nun 200 U / ml penisilin modifiye kartal orta (DMEM), 200 mg / ml streptomisin, 5 mg / ml fungizone
3. Kültür ortamı
   Koleksiyon orta% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu içeren

I. Doku toplama ve depolama

Hasta doku toplanması için Onay Klinik Araştırmalar Etik Kurulu Cork Hastaneler Öğretim elde edildi ve hastalar operasyondan bir gün önce bilgilendirilmiş onam alınmıştır. Malign hastalık için kısmi hepatektomi uygulanan hastalarda karaciğer dokusu elde edildi.

1. Taze hasta doku cerrahi rezeksiyon zaman elde edilir.
2. Doku toplama medya saklanan 4 ° C (Doku canlılığı kaybı olmadan 12 saat kadar buzdolabında saklanabilir, ancak hemen işleme tavsiye edilir).

II. Doku dilim hazırlanması ve kültür

Dilimleme bir vibratome (Leica, Almanya) kullanılarak yapıldı. Üreticinin talimatlarına göre doku dilimleme sistemi kullanılmıştır. Doku dilim hazırlanması% 70 2-propanol ile temizlenmelidir aletler kullanılarak steril bir başlık altında yapıldı. Dilim kalınlığı 2000 mikron ve pistonlu 22-26 rpm'de bıçak kullanılarak kesilir.

1. Doku antibiyotik solüsyon içinde üç defa yıkanır.
2. Doku, toksik olmayan yapıştırıcı (Dermabond) kullanarak montaj aşamasında eklenir.
3. Dilim kalınlığı ayarlanır ve dilimleme 22-26 dak elde edilir.
4. Dilimler 37 6 kuyu kültür yemekleri (her bir dilim) kültür ortamında muhafaza ° C,% 5 CO ₂ nemlendirilmiş bir ortam.

III. Gen teslim doku dilimleri

1. Dilimler ° C 2 saat önce 37 tedavi öncesi inkübe edilir.
2. Kültür orta tedavi orta ile değiştirilir.
3. Dilimler, viral vektör (viral parçacıkların 25 ul Ad5.CMVluc ^{[1x10 9]).} Doğrudan enjekte edilir Alternatif olarak, pasif infüzyon için parçacıklar, orta eklendi olabilir.
4. Inkübasyon iki saat sonra, serum orta eklenir.

IV. Bioluminescent analizi ile gen ekspresyon analizi

1. Dilimler 100 ul luciferase substrat (3 mg / ml) enjekte edilir.
2. 6-sıra kültür kaplarına yerleştirilir ve sahnede 10 dakika inkübe edilir.
3. Dilimler, yüksek hassasiyeti (Şekil 1) 5 dakika görüntülü.

V. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1 IVIS algılama sistemi kullanarak hastanın karaciğer dilim Bioluminescent görüntüleme.

Tartışmalar

Biz ex vivo olarak hasta doku kültürü yöntemi ve insan doku içinde sabit olmayan gen teslim değerlendirilmesi için bioluminescent algılama sistemi açıklanmaktadır. Bu yöntem basit ve tekrarlanabilir bir kültür dokusu dilim bir şekilde sunmaktadır. Malign doku da dahil olmak üzere çeşitli insan doku içine bozulmamış insan dokusu içine gen teslim çalışmada, gen teslim analizini sağlar ve saygı ile bireysel hastalar arasında değişkenlik derecesi yüksek olan etkileri ile ilgili önem...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Firefly Luciferin	Biosynth International, Inc
Dermabond	Johnson & Johnson
Vibrotome	Leica Microsystems	VT 1000 A