Экс Vivo культуры тканей пациента и изучение генов доставки

Резюме

В этой статье описывается культура пациента ломтиками ткани для доставки генов исследования и последующего анализа экспрессии генов использованием ИВИС биолюминесценции изображений.

Аннотация

Это видео описывает использование тканей пациента, как бывшие модели естественных условиях для изучения доставки генов. Свежий ткани пациента получены во время операции нарезанный и поддерживаться в культуре. Бывшие модели системы естественных условиях позволяет физическая доставка генов в неповрежденной ткани пациента и экспрессии генов анализируется биолюминесценции визуализации с использованием системы ИВИС обнаружения. Биолюминесцентного системы обнаружения демонстрирует быстрое и точное количественное экспрессии генов в отдельных ломтиков без необходимости ткани жертвы. Эта культура срез ткани система может быть использована в самых разных типов тканей, включая нормальных и злокачественных тканей и позволяет изучать последствия гетерогенный характер неповрежденной ткани и высокая степень изменчивости между отдельными пациентами. Эта модель система может быть использована в определенных ситуациях в качестве альтернативы животных моделях и в качестве дополнительного доклинических режиме до входа в клинических испытаниях.

протокол

Подготовка медиа и реагенты

1. Раствором антибиотика
   Фосфатным буферным раствором (PBS) с 200 ед / мл пенициллина, 200 мкг / мл стрептомицина, 5 мкг / мл Fungizone
2. Сбор и очистка среды
   Дульбеко изменение орел среды (DMEM) с 200 ед / мл пенициллина, 200 мкг / мл стрептомицина, 5 мкг / мл Fungizone
3. Культура среда
   Коллекция среде, содержащей 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки

И. коллекции тканей и хранения

Утверждение для пациента коллекции тканей была получена из Клинические исследования этическим комитетом больницы Корк Обучение и информированное согласие было получено от пациентов за день до операции. Ткани печени была получена из пациентов, перенесших частичную резекцию печени злокачественных заболеваний.

1. Свежий ткани пациента получается во время хирургической резекции.
2. Ткань хранится в коллекции средств массовой информации при 4 ° С (ткани, может храниться в холодильнике до 12 ч без значительной потери жизнеспособности, однако немедленной обработки рекомендуется).

II. Ткань подготовки ломтик и культуры

Нарезки проводили с использованием vibratome (Leica, Германия). Ткани нарезки система была использована в соответствии с инструкциями производителя. Подготовка ткани срез был выполнен под капотом стерильной используя инструменты очищаются 70% 2-пропанола. Толщина среза устанавливается в размере 2000 микрон и обработке с использованием поршневых лезвием на 22-26 оборотов в минуту.

1. Ткань промывают раствором антибиотика в три раза.
2. Ткань крепится к стадии монтажа использованием нетоксичных клей (Dermabond).
3. Толщина среза установлен и нарезая достигается при 22-26 оборотов в минуту.
4. Фрагменты сохраняются в культуральной среде в 6-и культуре блюд (один ломтик на лунку) при 37 ° C с 5% СО ₂ во влажной среде.

III. Гена доставки срезы тканей

1. Ломтики предварительно инкубировали при 37 ° С в течение 2 ч до начала лечения.
2. Культура среду заменяют лечение среды.
3. Ломтики непосредственно вводили вирусный вектор (25 мкл вирусных частиц Ad5.CMVluc [1x10 ^9]). Кроме того, частицы могут быть добавлены к среде, для пассивных инфузии.
4. После двух часов инкубации сыворотки добавляется в среду.

IV. Анализ экспрессии генов с биолюминесцентного анализа

1. Ломтики вводят 100 мкл люциферин подложки (3 мг / мл).
2. 6-а блюдо культуры находится на сцене, и выдерживают в течение 10 мин.
3. Ломтики изображаются в течение 5 мин при высокой чувствительности (рис. 1).

Результаты В. представитель

Рисунок 1. Биолюминесцентный изображений пациента ломтика печени использованием ИВИС системы обнаружения.

Обсуждение

Мы описываем бывших естественных тканей пациента методом культуры и биолюминесцентного системы обнаружения для оценки доставки генов в нефиксированной ткани человека. Метод предлагает простые и воспроизводимые способ ломтиками культивирования тканей. Он имеет значительный по...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Firefly Luciferin	Biosynth International, Inc
Dermabond	Johnson & Johnson
Vibrotome	Leica Microsystems	VT 1000 A