JoVE Logo

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • протокол
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье описывается культура пациента ломтиками ткани для доставки генов исследования и последующего анализа экспрессии генов использованием ИВИС биолюминесценции изображений.

Аннотация

Это видео описывает использование тканей пациента, как бывшие модели естественных условиях для изучения доставки генов. Свежий ткани пациента получены во время операции нарезанный и поддерживаться в культуре. Бывшие модели системы естественных условиях позволяет физическая доставка генов в неповрежденной ткани пациента и экспрессии генов анализируется биолюминесценции визуализации с использованием системы ИВИС обнаружения. Биолюминесцентного системы обнаружения демонстрирует быстрое и точное количественное экспрессии генов в отдельных ломтиков без необходимости ткани жертвы. Эта культура срез ткани система может быть использована в самых разных типов тканей, включая нормальных и злокачественных тканей и позволяет изучать последствия гетерогенный характер неповрежденной ткани и высокая степень изменчивости между отдельными пациентами. Эта модель система может быть использована в определенных ситуациях в качестве альтернативы животных моделях и в качестве дополнительного доклинических режиме до входа в клинических испытаниях.

протокол

Подготовка медиа и реагенты

  1. Раствором антибиотика
    Фосфатным буферным раствором (PBS) с 200 ед / мл пенициллина, 200 мкг / мл стрептомицина, 5 мкг / мл Fungizone
  2. Сбор и очистка среды
    Дульбеко изменение орел среды (DMEM) с 200 ед / мл пенициллина, 200 мкг / мл стрептомицина, 5 мкг / мл Fungizone
  3. Культура среда
    Коллекция среде, содержащей 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки

И. коллекции тканей и хранения

Утверждение для пациента коллекции тканей была получена из Клинические исследования этическим комитетом больницы Корк Обучение и информированное согласие было получено от пациентов за день до операции. Ткани печени была получена из пациентов, перенесших частичную резекцию печени злокачественных заболеваний.

  1. Свежий ткани пациента получается во время хирургической резекции.
  2. Ткань хранится в коллекции средств массовой информации при 4 ° С (ткани, может храниться в холодильнике до 12 ч без значительной потери жизнеспособности, однако немедленной обработки рекомендуется).

II. Ткань подготовки ломтик и культуры

Нарезки проводили с использованием vibratome (Leica, Германия). Ткани нарезки система была использована в соответствии с инструкциями производителя. Подготовка ткани срез был выполнен под капотом стерильной используя инструменты очищаются 70% 2-пропанола. Толщина среза устанавливается в размере 2000 микрон и обработке с использованием поршневых лезвием на 22-26 оборотов в минуту.

  1. Ткань промывают раствором антибиотика в три раза.
  2. Ткань крепится к стадии монтажа использованием нетоксичных клей (Dermabond).
  3. Толщина среза установлен и нарезая достигается при 22-26 оборотов в минуту.
  4. Фрагменты сохраняются в культуральной среде в 6-и культуре блюд (один ломтик на лунку) при 37 ° C с 5% СО 2 во влажной среде.

III. Гена доставки срезы тканей

  1. Ломтики предварительно инкубировали при 37 ° С в течение 2 ч до начала лечения.
  2. Культура среду заменяют лечение среды.
  3. Ломтики непосредственно вводили вирусный вектор (25 мкл вирусных частиц Ad5.CMVluc [1x10 9]). Кроме того, частицы могут быть добавлены к среде, для пассивных инфузии.
  4. После двух часов инкубации сыворотки добавляется в среду.

IV. Анализ экспрессии генов с биолюминесцентного анализа

  1. Ломтики вводят 100 мкл люциферин подложки (3 мг / мл).
  2. 6-а блюдо культуры находится на сцене, и выдерживают в течение 10 мин.
  3. Ломтики изображаются в течение 5 мин при высокой чувствительности (рис. 1).

Результаты В. представитель

figure-protocol-2961
Рисунок 1. Биолюминесцентный изображений пациента ломтика печени использованием ИВИС системы обнаружения.

Обсуждение

Мы описываем бывших естественных тканей пациента методом культуры и биолюминесцентного системы обнаружения для оценки доставки генов в нефиксированной ткани человека. Метод предлагает простые и воспроизводимые способ ломтиками культивирования тканей. Он имеет значительный по...

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа финансировалась через Корк Южной больнице Виктория университетской больницы груди фонда, ирландского общества рака (CRI07TAN) и Научно-исследовательского онкологического центра Корка. Репликация некомпетентных рекомбинантный аденовирус 5 частиц под транскрипционным контролем промотора CMV был своего рода подарок от профессора Эндрю Бейкер, Университет Глазго.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMSigma-AldrichD6429
PBSSigma-AldrichD8537
Firefly LuciferinBiosynth International, Inc
DermabondJohnson & Johnson
VibrotomeLeica MicrosystemsVT 1000 A

Ссылки

  1. van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Draaisma, A. L., Merema, M. T., Bezuijen, J. I., van Gils, M. J. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicol Sci. 85, 632-638 (2005).
  2. Speirs, V., Green, A. R., Walton, D. S., Kerin, M. J., Fox, J. N., Carleton, P. J. Short-term primary culture of epithelial cells derived from human breast tumours. Br J Cancer. 78, 1421-1429 (1998).
  3. Kirby, T. O., Rivera, A., Rein, D., Wang, M., Ulasov, I., Breidenbach, M. A novel ex vivo model system for evaluation of conditionally replicative adenoviruses therapeutic efficacy and toxicity. Clin Cancer Res. 10, 8697-8703 (2004).
  4. Josserand, V., Texier-Nogues, I., Huber, P., Favrot, M. C., Coll, J. L. Non-invasive in vivo optical imaging of the lacZ and luc gene expression in mice. Gene Ther. 14, 1587-1593 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

46

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены