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Method Article
一个3D系统培养人关节软骨在滑液的高层次描述。滑液反映关节软骨的最自然的微环境,并可以很容易地获得和存储。因此,该系统可用于软骨再生研究和筛选疗法治疗关节炎。
软骨破坏的骨性关节炎的病理特征是中央在美国的事业,一个残疾的领先。在成人软骨没有非常有效的再生,在体内,因此,骨关节炎导致不可逆转的软骨丢失及伴有慢性疼痛和行动不便 1,2 。软骨组织工程提供了有希望的潜在的再生和恢复组织功能。这种技术通常涉及到播种天然或人工合成的支架和培养软骨细胞产生的三维构造过了一段时间,在一个平衡的介质中的工程目标的生物化学和生物力学成熟的组织 ,可以在体内3-6成缺损部位移植。软骨组织工程的成功实现,为软骨细胞的生长和外基质沉积的最佳条件是必不可少的。
在本机的关节腔,在北极的软骨ular表面的骨沐浴在滑液。这清晰和粘性流体股骨头关节软骨提供营养,并包含 7,8软骨细胞代谢的重要生长因子,细胞因子和酶。此外,滑液有利于低摩擦的软骨表面之间的运动,主要是通过分泌两个重要组成部分, 透明质酸和 lubricin 9 10。与此相反,组织工程化软骨是最常见的人工培养基培养。虽然这些媒体很可能能够为研究软骨细胞代谢提供更明确的条件,滑液最准确地反映关节软骨细胞,其中居住的自然环境
事实上,滑液容易获取和存储的优势,往往可以定期身体补充。一些团体补充滑液在培养基中的人类,牛,兔和狗的彗星hondrocytes,但主要用于滑液(低于20%)11-25只低的水平。虽然鸡,马和人类的软骨细胞已在滑液的百分比较高的中等培养,这些文化系统二维26-28。在这里,我们目前在3D系统培养人关节软骨细胞的方法,我们与滑液的高(可达100%)的比例超过21天的期限。这样做,我们克服了滑液的高粘度提出的一个主要障碍。该系统提供学习人体软骨在滑液在3D设置,可进一步与其他两个重要因素(氧张力和机械负荷)29,30,软骨构成的自然环境,模仿自然的环境相结合的可能性软骨生长。此外,该系统也可用于化验滑液对软骨细胞的活动,并为发展中国家提供了一个平台软骨再生技术和关节炎的治疗方案。
一个培养人关节软骨细胞的三维系统在滑液
在这项工作中,我们人体关节软骨细胞封装在使用修改后的制造商建议的封装协议( 龙沙 ,和31)的海藻酸钠珠。使用这些三维结构,我们已经发展为培养细胞中含有人体滑液的不同比例的中等文化制度和评估软骨基因表达的这些三维结构。
1。准备人关节软骨细胞三维(3D)封装(HAC)
2。封装成3D珠HACS
重悬在1.2%的海藻酸钠溶液(Sigma公司)在8x10 的 5细胞/ ml密度HACS 。手机号码之前确定封装,使用标准的细胞计数。这是非常重要拌匀,以确保即使细胞分布在珠。
3。滑液培养基培养软骨细胞
4。在褐藻胶珠的收获HACS基因表达分析
从基因表达分析海藻酸钠珠HACS收获时必须特别小心。
5。修复组织学分析海藻酸钠珠HACS
特别注意将要采取的收获从组织学分析3D珠HACS。
6。代表性的成果
我们在滑液的高百分比的人软骨细胞的三维培养方法是描绘在图1所示的示意图。人类软骨细胞在海藻酸钠珠封装后,他们被允许在培养基中不同程度的滑液比增长。由于滑液的粘度,它是必不可少的文化的软骨细胞不断摇摆条件下,以防止软骨结构的聚集和确保的营养素的均匀分布。它也是必不可少的海藻酸钠珠洗前广泛检索的软骨细胞,所以,固定或裂解液可以穿透珠(图1)。明场(BF)的软骨细胞在褐藻胶珠图像如图2所示。 DAPI染色进行确认usniform分布在珠的细胞(图2)。在为期21天的文化时期的结束,QRT - PCR基因表达分析。参照基因GAPDH被用于所有PCR的正常化,因为它被确定为最可靠的参考基因的qPCR分析软骨细胞32。如图就是一个例子。 3,在这里我们从人类汇集从六个骨关节炎患者滑液关节软骨细胞培养的结果进行分析。符合事实,从软骨细胞龙沙已在2D文化的扩大,这将不可避免地导致脱分化 33,我们发现,0天软骨细胞软骨基质基因表达的最低水平(图3 )。三维培养软骨细胞与软骨细胞分化培养基(龙沙)或滑液培养基显著增加软骨的胶原蛋白,蛋白聚糖和MMP13,这表明第21天(图)34的软骨细胞重新分化的基因表达。在媒体的百分比增加滑液导致软骨基质标志物Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达(图3A和3B)相媲美的水平。此外,在100%滑液培养软骨细胞软骨降解酶MMP13 mRNA表达减少甚至表现出比那些在培养中单(图3c)。有趣的是,细胞死亡指标caspase 3的表达水平逐渐下降与增加滑液的比率,表明即Synovial液培养,导致细胞凋亡水平下降(图3D)。因此,我们的结果表明,在一个3D的环境中滑液的高层次培养人关节软骨细胞是一种可行的技术。
表格和图表
图1。示意图文化在3D海藻酸钠珠滑液的高百分比的人关节软骨细胞的方法。首先,软骨细胞和海藻酸钠溶液混合。当应用于下降明智的氯化钙溶液中,软骨细胞固定内钙交联海藻酸钠水凝胶珠。这些三维结构,然后培养软骨细胞的分化培养基(龙沙)在不同的人体滑液比。摇摆条件下培养21天之后,含有细胞的海藻酸钠珠洗广泛的基因后,细胞检索表达分析。
图2。明场(BF)和人关节软骨细胞的DAPI 0%,30%,50%,70%和100%滑液封装的文化图像。软骨细胞在培养条件下,在所有形状的球形。明场(BF)和大埤图像叠加确认软骨细胞的位置和分布。 Insets的,放大的图像。箭镞,BF和DAPI染色图像的软骨细胞共定位。
图3。QRT - PCR封装人类关节软骨细胞的分析0天(D0)经过21天的培养基中培养(D21),辅以不同比率的滑液(SF)(0%,30%,50% ,70 %和100%)。 4个独立样本的结果如下所示。 GAPDH被用作内部参考所有PCR的。 一个。 Ⅱ型胶原mRNA的表达,B。蛋白聚糖mRNA的表达,C。 MMP13 mRNA的表达,D。 Caspase 3的mRNA表达。被评定为第0天样品和21天0%和100%的样品滑液(SF)的培养,使用InStat的软件有统计学意义。 *表示P <0.05;
在这份报告中,我们开发了一个人关节软骨细胞培养的方法,允许在一个中型的3D环境,它包含人体滑液的高浓度。滑液的主要成分构成的关节腔,关节软骨细胞所在的自然环境之一。然而,滑液的粘度一直是立体培养软骨细胞的长期的重大挑战。要克服的挑战,保持甚至养分分布在三维构造在粘稠的环境,并防止聚集,我们将不断的运动,温和的摇摆下的软骨结构。为了提高结构的软骨结构完?...
我们什么都没有透露。
我们想感谢提供帮助滑液存储和离心罗宾奈(塔夫茨医学中心),智也内村和Dana凯恩斯(塔夫茨大学)。这项工作是由NIH(1R01AR059106 - 01A1为LZ)
特定的试剂和设备表:
试剂名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
---|---|---|---|
海藻酸钠(褐藻酸的钠盐) | 西格玛 | A2158 - 250G | 2.4%的溶液储存在40 ° C |
二水氯化钙,颗粒 | JT贝克 | A19339 | |
软骨生长介质 | 龙沙 | CC - 3156(底座媒体) | |
CC - 4409(增刊) | |||
软骨分化媒体 | 大号onza | CC - 3226(底座媒体) | |
CC - 4408(增刊) | |||
人关节软骨细胞 | 龙沙 | CC - 2550 | |
DAPI(4',6 - Diamidino - 2 -苯基吲哚盐酸盐) | Sigma - Aldrich公司 | D9542 | |
的RNeasy迷你试剂盒(RNA提取) | Qiagen公司 | 74104 | |
PCR试剂:SYBR绿色 | 广达 | 95053-500 | |
12毫升注射器 | 泰科-肯德尔 - Monoject | 512852 | |
22 Gague注射针 | 泰科 - 肯德尔L - Monoject | 8881 | |
显微镜 | 奥林巴斯 | IX71 | |
平台摇杆 | Thermoscientific thermolyne | 可变混合 | |
引物序列 | |||
胶原蛋白第IIa进 | 5' - TTC ATC CCA CCC认证的TCT CAC AGT - 3' | ||
胶原蛋白第IIa -反向 | 5' - CCTCTGCCTTGACCCGAA - 3' | ||
MMP13,正转 | 5' - TGT GCC铁通铁通CAC ACA GAC的ACT - 3' | ||
MMP13反向 | 5' - GAG AGC AGA铁通TGA GTC ATT GCC - 3' | ||
Caspase 3的进 | 5' - TCA TTC AGG TTA CCT的海湾合作委员会的GTG GTA - 3' | ||
Caspase 3的反向 | 5' - TGG ATG AAC CAG GAG共同国家评估台泥TTT -3' |
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