Um Sistema de 3D para condrócitos Cultivar Humanos Articular no líquido sinovial

Resumo

Um sistema 3D de condrócitos articular humana cultivo em altos níveis de líquido sinovial é descrita. Líquido sinovial reflete o microambiente mais natural para a cartilagem articular, e pode ser facilmente obtido e armazenado. Esse sistema, portanto, pode ser usado para estudar a regeneração da cartilagem e para terapêutica de triagem para tratamento da artrite.

Resumo

Destruição da cartilagem é uma característica central patológicas da osteoartrose, uma das principais causas de incapacidade em os EUA. Cartilagem no adulto não se regenera de forma muito eficiente in vivo, e como resultado, osteoartrite causa a perda irreversível da cartilagem e é acompanhada por dor crônica e ^1,2 imobilidade. Cartilagem engenharia de tecidos oferece grande potencial para regenerar e restaurar a função do tecido. Esta tecnologia envolve tipicamente condrócitos semeadura em andaimes natural ou sintético e cultivar o 3D, resultando em um meio de construir equilibrada ao longo de um período de tempo com um gol de um tecido de engenharia bioquímica e biomecanicamente madura que pode ser transplantado para um local do defeito in vivo ^3-6 . Atingir uma condição ideal para o crescimento de condrócitos e deposição de matriz é essencial para o sucesso da cartilagem engenharia de tecidos.

Cartilagem na articulação cavidade nativa, na articular superfície do osso é banhada no líquido sinovial. Este líquido claro e viscoso fornece nutrientes para a cartilagem articular avascular e contém fatores de crescimento, citocinas e enzimas que são importantes para o metabolismo dos condrócitos ^7,8. Além disso, o líquido sinovial facilita o movimento de baixa fricção entre superfícies cartilaginosas principalmente através de secretar dois componentes-chave, ácido hialurônico e lubricin ^{9 10.} Em contraste, a cartilagem da engenharia de tecidos é mais freqüentemente cultivados em meio artificial. Enquanto esses meios são susceptíveis capaz de proporcionar condições mais definido para o estudo do metabolismo dos condrócitos, líquido sinovial reflete com mais precisão o ambiente natural do qual condrócitos articular residem dentro

De fato, o líquido sinovial tem a vantagem de ser fácil de obter e armazenar, e muitas vezes podem ser reabastecidos regularmente pelo corpo. Vários grupos completaram o meio de cultura com líquido sinovial em crescimento humano, coelho, bovinos e cães chondrocytes, mas principalmente utilizados apenas os baixos níveis de líquido sinovial (abaixo de 20%) ^11-25. Enquanto condrócitos cavalo, galinha e humanos foram cultivadas em meio com maior percentual de líquido sinovial, estes sistemas de cultura eram bidimensionais ^26-28. Aqui apresentamos o nosso método de cultura de condrócitos articular humana em um sistema 3D, com uma alta porcentagem de líquido sinovial (até 100%) durante um período de 21 dias. Ao fazer isso, superamos um grande obstáculo apresentado pela alta viscosidade do fluido sinovial. Este sistema oferece a possibilidade de estudar os condrócitos humanos em líquido sinovial em um ambiente 3D, que pode ainda ser combinado com outros dois fatores importantes (tensão de oxigênio e carga mecânica) ^29,30 que constituem o ambiente natural para a cartilagem para imitar o ambiente natural para crescimento da cartilagem. Além disso, este sistema também pode ser utilizada para a dosagem de atividade líquido sinovial em condrócitos e fornecer uma plataforma para o desenvolvimentoregeneração da cartilagem tecnologias e opções terapêuticas para a artrite.

Protocolo

Um sistema 3D para cultivo de condrócitos articular humana em líquido sinovial

Neste trabalho, nós encapsulado condrócitos articular humana em esferas de alginato modificado usando um protocolo de produção, sugeriu o encapsulamento (Lonza, e ^31). Usando essas construções em 3D, nós desenvolvemos um sistema para a cultura de células em meio de cultura contendo percentuais variaram de líquido sinovial humana e avaliaram estas construções em 3D para a cartilagem da expressão gênica.

1. Prepare condrócitos articular humana (HAC) por três-dimensional encapsulamento (3D)

1. Descongelar um frasco (1 ml) de condrócitos articular humana (HAC) (Lonza) (Passage 2) em 37 ° C banho-maria por 1 min.
2. Misture com 1 ml de meio de crescimento de condrócitos (Lonza) e centrifugar a 3000 rpm por 3-5 min para coletar as células. Desprezar o sobrenadante.
3. Ressuspender celular em meio de crescimento de condrócitos (Lonza).
4. Células da placa em um tecido de 10 cmplaca de cultura (BD Biosciences), e cultura em meios de crescimento de condrócitos (Lonza) até as células são confluentes. HACS deve ser usado em um número passagem não superior a 3 ou 4 (P3 ou P4).
5. Lavar HACS na placa com 155mm NaCl em vez do PBS padrão, seguido de trypsinzation para coletar células para encapsulamento de alginato talão. Uma vez que as células são separadas, spin para baixo as células a 3000rpm por 5min. As células estão agora prontos para encapsulamento 3D.

2. Encapsular HACS em grânulos 3D

Ressuspender o HACS em solução de alginato de 1,2% (Sigma) a uma densidade de 8x10 ⁵ células / ml. Número de células foram determinados antes de encapsulamento, utilizando um contador de células padrão. É muito importante para misturar bem para garantir uma distribuição uniforme das células as contas.

1. Pipetar os HAC / mistura solução de alginato em uma seringa 12 ml conectada a uma agulha de calibre 22 (Tyco Healthcare, Inc.).
2. Enquanto isso, prepare um copo de 50 mL com 102 mM CaCl ₂ em um volume 5 vezes maior do que a solução HAC / aginate. Coloque uma barra de agitação no interior do copo e agitar a 102 mM CaCl ₂ solução lentamente (aproximadamente a 150 rpm).
3. Segure a ponta da seringa cerca de 6 centímetros acima da superfície da solução de CaCl ₂ e adicione a mistura HAC / alginato na solução de CaCl ₂ gotas. Em geral, os grânulos de alginato resultantes são dois milímetros de diâmetro, com uma densidade de encapsulamento de cerca de 10 ⁴ células / talão. Nota: A altura da seringa sobre a solução CaCl ₂ é importante. Distância mais curta irá resultar em gota em forma esférica, em vez de contas em forma, fazendo com que a integridade mecânica irregular e encapsulamento de células.
4. Vamos agitar as contas na solução CaCl ₂ por 20-25 min. Enquanto outros protocolos de encapsulamento alginato indicam um tempo de incubação mais curto de 10 minutos, descobrimos que o tempo de incubação com a solução de CaCl ₂ maior a integridade do seranúncios.
5. Remover a solução CaCl _2, lavar as contas em 2-3, 2-3 vezes volumes de NaCl, e depois uma vez em meio de diferenciação dos condrócitos (Lonza). Enquanto outros alginato de protocolos de encapsulamento envolvem o uso de talão de um filtro para os procedimentos de lavagem acima, descobrimos que os grânulos de alginato, muitas vezes ficam presas no filtro para fora e seca, reduzindo assim a eficiência de encapsulamento. Encontrámo-lo mais eficiente para permitir que os grânulos se depositem no fundo do copo antes de descartar a solução.
6. Use uma espátula padrão para transferir as contas em placas de cultura. Nós cultura normalmente de 12 contas por três centímetros bem para dois dias em meio de crescimento de condrócitos para permitir que os condrócitos se ajustar ao processo de encapsulamento no meio em que foram cultivadas em meio antes de mudar para a diferenciação de condrócitos (Lonza) com líquido sinovial.

3. Condrócitos cultura em meio de cultura líquido sinovial

1. Líquido sinovial fresco pode ser obtido a partir de um oclínica utpatient (Obtivemos líquido sinovial de Tufts Medical Center). O líquido sinovial pode ser transferido em tubos de 15ml falcon para o laboratório, e imediatamente centrifugadas a 3000 rpm por 15 min para remover restos celulares. Alíquota livre de células do líquido sinovial em tubos de 1,5 mL de microcentrífuga, para evitar repetidos de congelamento-descongelamento. Sobrenadante pode ser armazenada a -80 ° C até o uso.
2. Antes de cultivo, misture o líquido sinovial com meio de diferenciação dos condrócitos (CDM, Lonza) em diferentes proporções volumétricas, com uma concentração constante de ácido ascórbico 100mM e 9 mM CaCl ₂ (esta quantidade traço de CaCl ₂ é garantir a integridade do alginato esferas).
3. Manter a placa em uma plataforma de balanço em uma incubadora de 37 ° C (freqüência de balanço: cerca de 75 vezes / min) para ajudar a distribuição de nutrientes dentro do alginato, e para reduzir a aglutinação das contas. Isto é especialmente importante à medida que a cultura destes condrócitos por um período prolongado de tempo (até 4 semanas). Nota: Embora o crescimento de condrócitos e mídia diferenciação (Lonza) contêm dois antibióticos comumente utilizados gentamicina e anfotericina, não tínhamos qualquer suplemento de antibióticos quando usamos diferentes percentuais de líquido sinovial para cultura de condrócitos. Nenhuma contaminação foi já observado.
4. Alterar media misturas cada 2-3 dias. A viscosidade do líquido sinovial tem sido um grande obstáculo em condrócitos cultura encapsulado em grânulos de alginato durante a longo prazo culturas. Encontrámo-lo mais eficaz para diluir meio fluido sinovial suplementado com 102mm CaCl ₂ (50% V / V), que também fortalece a integridade das esferas de alginato. Desta forma, o meio pode lentamente ser removido com uma pipeta, sem prejudicar as contas.

4. HACS colheita em grânulos de alginato para a análise de expressão gênica

Cuidados especiais devem ser tomados quando a colheita da HACS dos grânulos de alginato para a análise da expressão gênica.

1. Lavar as esferas de alginato 3 times em 102 mM CaCl ₂ para cerca de 5 min de cada vez.
2. Recuperar os condrócitos, adicionando 55 NaCitrate mM em um volume 4-5 vezes maior do que os grânulos. É importante que os grânulos de alginato são totalmente imersos na solução NaCitrate. Agitar ou rocha por 20-30 min.
3. Girar as células e desprezar o sobrenadante.
4. RT-PCR para análise, ressuspender o pellet celular em tampão de lise celular (Qiagen RNA isolamento kit), e prosseguir com purificação de RNA.

5. Fix HACS em grânulos de alginato para análise histológica

Cuidados especiais devem ser tomados para colher o HACS dos grânulos 3D para análise histológica.

1. Lavar as esferas de alginato de 3 vezes em 102 mM CaCl ₂ para cerca de 5 min de cada vez. Completamente lavar o fluido viscoso sinovial, achamos mais eficaz de lavagem com meio de diferenciação dos condrócitos (Lonza) durante a noite, balançando em um 37 ° C incubadora frequência de balanço (: sobre o tempo 75s / min). O meio de crescimento de condrócitos foi usado para garantir a sobrevivência de condrócitos neste lavagem prolongada e para permitir a máxima penetração do agente de fixação.
2. Corrigir as contas em etanol 70% durante a noite, e prosseguir com a análise histológica. Para executar a coloração DAPI, incubar alginato com DAPI solução (500ng/ml) para 1hr sob balanço delicado, e lavar por 3 vezes com 102mm CaCl ₂ por 15 min a cada vez. DAPI imagens podem ser vistas sob um microscópio fluorescente. As contas também pode ser seccionado para alcian blue e coloração H & E.

6. Resultados representante

Nosso método de cultivo em 3D para condrócitos humanos em elevadas percentagens de líquido sinovial é descrita no diagrama esquemático mostrado na Fig.1. Depois de condrócitos humanos foram encapsuladas em esferas de alginato, eles foram autorizados a crescer em meio suplementado com diferentes proporções de líquido sinovial. Por causa da viscosidade do fluido sinovial, é essencialcondrócitos cultura em condições de balanço constante para evitar o acúmulo de construções cartilagem e para assegurar uma distribuição uniforme dos nutrientes. Também é essencial lavar as esferas de alginato extensivamente antes de recuperar os condrócitos, de modo que a fixação ou tampão de lise podem penetrar as esferas (Fig.1). Brilhante campo (BF) imagens de condrócitos na alginato são mostrados na Fig.2. Coloração DAPI foi realizada para confirmar a distribuição usniform das células dentro das contas (Fig. 2). No final do período de cultura de 21 dias, a análise de expressão gênica foi realizada por qRT-PCR. A referência gene GAPDH foi utilizada para a normalização de todos os PCRs, pois estava determinado a ser um dos genes de referência mais confiável para análise de qPCR condrócitos ^32. Um exemplo é mostrado na figura. 3, onde foram analisados ​​os resultados de condrócitos articular humana cultivadas no líquido sinovial obtidos a partir de seis pacientes com osteoartrite. Consistente com o fato de que os condrócitos a partirLonza foram expandidos em culturas 2D, o que conduziria inevitavelmente a de ^{diferenciação-33,} descobrimos que o Dia 0 condrócitos expressa níveis mínimos de genes matriz da cartilagem (Fig. 3). 3D cultura de condrócitos com meio de diferenciação dos condrócitos (Lonza) ou meio suplementado com líquido sinovial aumentado significativamente cartilagem expressão gênica de colágeno, aggrecan e MMP13, o que indica condrócitos re-diferenciação por Dia 21 (Fig.3) ^34. Aumento da percentagem de líquido sinovial na mídia resultou em níveis comparáveis ​​da matriz da cartilagem marcadores de colágeno II e da expressão de mRNA aggrecan (Fig.3 e 3B). Além disso, condrócitos cultivados em 100% fluido sinovial mesmo exibiu uma diminuição na cartilagem degradante expressão do mRNA da enzima MMP13, em comparação com aquelas cultivadas em meio sozinho (Fig.3C). Curiosamente, o nível de expressão de morte celular indicador de caspase 3 diminuiu gradualmente com relações cada vez maior de líquido sinovial, sugerindo que scultura líquido ynovial levou a níveis de apoptose diminuiu (Fig. 3D). Portanto, nossos resultados mostram que os condrócitos articular humana cultivo em altos níveis de líquido sinovial em um ambiente 3D é uma tecnologia viável.

Tabelas e Figuras

Figura 1. Diagrama esquemático do método para a cultura humana condrócitos articular em elevadas percentagens de líquido sinovial em grânulos de alginato 3D. Primeiro, condrócitos e solução de alginato são misturados. Quando aplicado gota a gota, à solução CaCl _2, condrócitos são imobilizadas dentro do reticulado grânulos de alginato-Ca hidrogel. Essas construções 3D são então cultivados em meio de diferenciação dos condrócitos (Lonza) com diferentes proporções de líquido sinovial humana. Após 21 dias de cultivo sob uma condição de balanço, contas de alginato contendo células são lavadas exaustivamente após a qual as células são obtidas para o geneanálise de expressão.

Figura 2. Campo Bright (BF) e imagens DAPI de condrócitos articular humana culturas encapsulado com 0%, 30%, 50%, 70% e 100% líquido sinovial. Condrócitos foram esférico na forma em todas as condições de cultura. Imagens de campo claro (BF) e DAPI foram sobrepostos para confirmar a localização e distribuição dos condrócitos. Inserções, as imagens ampliadas. Pontas de flechas, co-localização de condrócitos em BF e imagens coloração DAPI.

Figura 3. QRT-PCR análise de condrócitos articular humana encapsulado no dia 0 (D0) uma após 21 dias de cultivo (D21), em meio suplementado com proporções variáveis ​​de líquido sinovial (SF) (0%, 30%, 50%, 70 % e 100%). Resultados de quatro amostras independentes são mostrados aqui. GAPDH foi utilizado como referência interna para todos os PCRs. A. Expressão de mRNA de colágeno II. B. Agrecan expressão mRNA. C. MMP13 expressão mRNA. D. Caspase expressão de RNAm 3. Significância estatística foi avaliada para o Dia 0 Dia amostras e 21 amostras de 0% e 100% líquido sinovial (SF) cultura, utilizando o software Instat. * Indica P <0,05.

Discussão

Neste relatório, nós desenvolvemos um método que permite a cultura de condrócitos articular humana em um ambiente 3D em meio que contém altas concentrações de líquido sinovial humana. Líquido sinovial é um dos principais componentes que constituem o ambiente natural na cavidade articular, onde condrócitos articular reside. No entanto, a viscosidade do líquido sinovial tem sido um grande desafio para tridimensional de cultura de longo prazo dos condrócitos. Para superar o desafio de manter uma distribuição...

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número Catálogo	Comentários
Alginato (sal de sódio de ácido algínico)	Sigma	A2158-250G	Solução 2,4% armazenadas a 40 ° C
Cloreto de cálcio dihidratado, Granular	JT Baker	A19339
Condrogênicos media Crescimento	Lonza	CC-3156 (base de mídia)
		CC-4409 (suplemento)
Condrogênicos Mídia Diferenciação	LOnza	CC-3226 (base de mídia)
		CC-4408 (suplemento)
Humana condrócitos articular	Lonza	CC-2550
DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato)	Sigma-Aldrich	D9542
RNeasy mini-kit (para extração de RNA)	Qiagen	74104
PCR reagentes: SYBR-verde	Quanta	95053-500
12 ml da seringa	Tyco-Kendall-Monoject	512852
22 Gague-Agulha Hipodérmica	Tyco-Kendall-Monoject	8881
Microscópio	Olimpo	IX71
Rocker plataforma	Thermolyne Thermoscientific	Vari-mix
Seqüências de primers
Colágeno IIa-forward	5'-CCA CCC TTC ATC TCT CAC AGT-3 '
Colágeno IIa-reverse	5'-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3 '
MMP13-forward	5'-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3 '
MMP13-reverse	5'-GAG-AGC GTC TGA AGA CTT ATT CCG-3 '
Caspase 3-forward	5'-TCA TTC TTA AGG CCT GCC GTG GTA-3 '
Caspase 3-reverse	5'-TGG ATG AAC GAG CCA CAG TCC -3 TTT "