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요약

활액 액체 높은 수준의 culturing 인간의 관절 chondrocytes의 3D 시스템이 설명되어 있습니다. 활액 액체는 관절 연골의 가장 자연 microenvironment을 반영하고, 쉽게 얻은하고 저장할 수 있습니다. 이 시스템은 따라서 연골 재생을 공부 및 관절염 치료를위한 심사 치료제 사용할 수 있습니다.

초록

연골 파괴는 관절염의 중심 병적인 기능, 미국에서 장애의 주요 원인이다. 성인의 연골은 생체내 매우 효과적으로 재생되지 않으며, 그 결과로 관절염은 연골 손실을 돌이킬에 이르게하고 만성 통증과 부동의 1,2와 함께합니다. 연골 조직 공학 조직 기능을 재생 및 복원하기 위해 유망한 가능성을 제공합니다. 이 기술은 일반적으로 결과 3D 엔지니어링의 목표 생체내 3-6 결함 사이트에 이식 수 화학적 및 biomechanically 성숙한 조직과 일정 기간 동안 균형 매체 만드는 천연 또는 합성 공사장 공중 발판과 culturing에 시딩 chondrocytes을 포함 . chondrocyte 성장과 매트릭스 증착을위한 최적의 조건을 달성하면 연골 조직 공학의 성공을 위해 필수적입니다.

북극의 원시 공동 캐비티, 연골에뼈 ular 표면은 활액 액체에서 목욕을합니다. 이 명확하고 점성 유체의 avascular 관절 연골에 영양분을 제공하고 성장 요인, 크린 시토킨 및 chondrocyte 신진 대사를 7,8에 대한 중요한 효소가 포함되어 있습니다. 또한, 활액 액체는 주로 secreting 두 가지 핵심 구성 요소, hyaluronan과 lubricin 9 10를 통해 연골 표면 사이의 낮은 마찰 운동을 용이하게합니다. 반면, 조직 공학 연골은 가장 자주 인공 미디어 양식입니다. 이러한 미디어 가능성이 chondrocyte 신진 대사를 공부에 대한 더 정의된 조건을 제공할 수 있지만, 활액 액체는 대부분 정확하게 관절 chondrocytes 안으로 거주하는 자연 환경을 반영

사실, 활액 액체가 얻고 저장하기 위해 쉽게되는 장점을 가지고 있으며, 자주 정기적으로 기관 보충함 수 있습니다. 몇몇 그룹은 성장 인간, 소, 토끼 및 개 C에서 활액 액체와 문화 매체를 보충해야hondrocytes하지만, 대부분의 활액 액체 (아래 20 %) 11-25 만 낮은 수준을 사용합니다. 닭, 말과 인간 chondrocytes는 활액 액체의 높은 비율과 매체 교양되었습니다 있지만, 이러한 문화 시스템은 2 차원 26-28되었습니다. 여기는 21 일 기간 동안 활액 액체의 높은 비율 (최대 100 %)과 3D 시스템에 culturing 인간의 관절 chondrocytes 우리의 방법을 제시한다. 이렇게, 우리는 활액 액체의 높은 점도로 표시 주요 장애물을 극복. 이 시스템은 더 이상을위한 자연 환경을 모방하는 연골에 대한 자연 환경을 구성하는 두 개의 다른 중요한 요소 (산소 긴장과 기계적 부하) 29,30와 함께 할 수있는 3D 설정에서 활액 액체 인간의 chondrocytes 공부의 가능성을 제공합니다 연골 성장. 또한,이 시스템은 또한 활액 chondrocytes에서 유체의 활동을 시금 사용 및 개발을위한 플랫폼을 제공 수 있습니다연골 재생 기술과 관절염에 대한 치료 옵션을 제공합니다.

프로토콜

활액 액체에 culturing 인간의 관절 chondrocytes을위한 3D 시스템

이 작품에서 우리는 수정된 제조 - 제안 캡슐화 프로토콜 (Lonza, 31)를 사용 알지네이트요 비즈 인간의 관절 chondrocytes를 캡슐. 이러한 3 차원 구조를 사용하여, 우리는 인간 활액 액체의 다양한 비율을 포함하는 문화 매체 culturing 전지 시스템을 개발 및 연골의 유전자 발현에 대해 이러한 3D 구조를 평가했습니다.

1. 입체 (3D) 캡슐에 대한 인간의 관절 chondrocytes (HAC)를 준비

  1. 37 일 분 ° C의 물을 욕조에 인간의 관절 chondrocytes (HAC) (Lonza) (항로 2) 유리병 (1 ML)을 녹여.
  2. chondrocyte 성장 미디어 (Lonza)와 세포를 수집하는 3-5 분 3,000 rpm으로 원심 분리기의 1ml와 함께 섞는다. 뜨는 폐기하십시오.
  3. chondrocyte 성장 미디어 Resuspend 세포 펠렛 (Lonza).
  4. 10cm 조직의 플레이트 세포문화 플레이트 (BD Biosciences) 및 chondrocyte 성장 미디어 (Lonza)의 문화가 세포가 합류 때까지. HACs없이 높은 세 이상 또는 4 (P3 또는 P4) 통로 번호를 사용해야합니다.
  5. 알지네이트요 비드 캡슐에 대한 세포를 수집하는 trypsinzation 다음 155mM NaCl 대신 표준 PBS와 함께 접시에 HACs 씻으십시오. 일단 세포가 분리되며, 5 분에 대한 3000rpm에서 세포를 다운 스핀. 세포는 이제 3D 캡슐에 대한 준비가되어 있습니다.

2. 3D 구슬로 HACs를 캡슐

8x10 5 셀 / ML의 밀도에 1.2 % 알지네이트요 솔루션 (시그마)의 HACs을 Resuspend. 휴대폰 번호는 표준 셀 카운터를 사용하기 전에 캡슐로 결정됩니다. 그것은 구슬에있는 세포의 균등을 보장하기 위해 잘 혼합하는 것은 매우 중요합니다.

  1. 피펫 22 게이지 바늘 (Tyco 의료, 주식 회사)에 연결된 12 ML 주사기로 HAC / 알긴산 솔루션 혼합물.
  2. 한편, 102m와 50 ML의 비커를 준비볼륨에서 M CaCl 2 5 회 HAC / aginate 솔루션의. 비커 안에 저어 막대를 놓고 (약 150 RPM에서) 천천히 102 MM CaCl 2 용액을 저어.
  3. CaCl 2 용액의 표면 위에 육인치에 대한 주사기의 끝부분을 잡고 CaCl 2 솔루션 dropwise로 HAC / 알긴산 혼합물을 추가합니다. 일반적으로 결과 알지네이트요 비즈는 약 10 4 세포 / 비드의 캡슐 밀도와 직경 2mm입니다. 참고 : CaCl 2 용액을 통해 주사기의 높이는 중요합니다. 짧은 거리는 고르지 않은 기계적 무결성과 세포를 캡슐 화 원인, 원형 모양의 구슬 대신 모양의 눈물 드롭집니다.
  4. 비즈가 20-25 분 CaCl 2 용액에서 저어 보자. 다른 알지네이트요의 캡슐화 프로토콜은 10 분 정도의 짧은 배양 시간을 나타내는 반면, 우리는 CaCl 2 용액과 함께 더 이상 부화 시간이 될의 무결성을 향상 발견광고.
  5. CaCl 2 용액을 제거 chondrocyte 차별화 매체 (Lonza)에 한 다음 2-3 번 NaCl로부터 2-3 권에 비즈를 씻어합니다. 다른 알지네이트요 비드 캡슐 프로토콜은 위의 세탁 절차 필터를 사용하여 포함하는 동안, 우리는 알지네이트요 비즈가 종종 따라서 캡슐의 효율성을 감소, 필터 및 드라이 아웃에 갇혀되고있는 것으로 나타났습니다. 우리는 가장 효율적인 비즈가 폐기되기 전에 비커의 바닥에 대한 해결책을 해결하도록 발견했습니다.
  6. 문화 요리에 비즈를 전송하는 표준 주걱을 사용합니다. 우리는 일반적으로 문화를 잘 chondrocyte 성장 매체 2 일간 3cm 당 12 구슬을 chondrocytes들이 전에 활액 액체와 chondrocyte 차별화 매체 (Lonza)에 스위칭 성장 있던 매체 캡슐 프로세스 조정할 수 있습니다.

3. 활액 유체 문화 매체 문화 chondrocytes

  1. 신선한 활액 액체는 O에서 구할 수 있습니다utpatient 클리닉 (우리는 Tufts 의료 센터에서 활액 액체를 취득). 활액 액체는 실험실로 15ml 팔콘 튜브에 전송하고, 즉시 세포 파편을 제거하는 15을 위해 3000 RPM에서 centrifuged 수 있습니다. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 나누어지는는 세포 무료 활액 액체, 동결 - 해동 반복되지 않도록합니다. 뜨는는 -80 ° C에서 사용까지 저장할 수 있습니다.
  2. 이전 culturing하기 위해 지속적인 100mM 아스코르비 산의 농도와 9 밀리 CaCl 2 (CaCl 2의이 추적 금액 알지네이트요의 무결성을 보장하는 것입니다과 체적 비율을 변화시 chondrocyte 차별화 매체와 활액 유체 (CDM, Lonza)를 혼합 구슬).
  3. 37 ° C 배양기에서 락을 플랫폼에서 번호판을 유지 (출렁 이는 주파수 : 약 75 회 / 분) 알지네이트요 비즈 내에서 영양 배포를 도와, 그리고 구슬의 clumping 줄일 수 있습니다. 이것은 장시간 (최대 4 주)에 대한 우리 문화의 이러한 chondrocytes와 같이 특히 중요합니다. 주의: chondrocyte 성장과 차별화 미디어 (Lonza는) 2 일반적으로 사용되는 항생제 gentamycin과 amphotericin를 포함하는 동안 우리는 chondrocyte culturing에 대한 활액 액체의 다른 비율을 사용할 때, 우리는 어떤 항생제를 보충하지 않았다. 오염이도 관찰되지 않았습니다.
  4. 모든 2-3일 미디어 혼합물을 변경합니다. 활액 유체의 점도는 장기적인 문화 중 알지네이트요 비즈에서 캡슐 culturing의 chondrocytes의 주요 장애물이었다. 우리는 또한 알지네이트요 비즈의 무결성을 강화 102mM CaCl 2 (50 % V / V)와 활액 유체 - 보충 미디어를 희석하는 것이 가장 효과적인 발견했습니다. 이러한 방법으로, 매체는 천천히 구슬을 손상시키지 않고, pipet로 제거할 수 있습니다.

4. 유전자 발현 분석을위한 알지네이트요 비즈에서 수확 HACs

유전자 발현 분석을위한 알지네이트요 비즈에서 HACs을 수확 때 특별한주의가 있어야합니다.

  1. 알지네이트요 비즈 - 3 TI 씻으십시오약 5 분 때마다 102 MM CaCl 2 대.
  2. 4-5 번 그 구슬의 볼륨에서 55 밀리미터의 NaCitrate을 추가하여 chondrocytes를 검색하십시오. 알지네이트요 비즈가 완전히 NaCitrate 솔루션에 열중하는 것이 중요합니다. 흔들거나 20-30 분 바위.
  3. 세포를 돌려서 뜨는 폐기하십시오.
  4. RT - PCR 분석을 위해, 세포 세포 용해 버퍼의 펠릿 (Qiagen RNA 격리 키트) 및 RNA 정화 진행을 resuspend.

5. histological 분석을 위해 알지네이트요 비즈에서 HACs을 수정

특별한주의가 histological 분석을위한 3D 비즈에서 HACs을 수확하기 위해주의가 필요하다.

  1. 5 분 약 때마다 102 MM CaCl 2의 알지네이트요 비즈에게 3 번 씻으십시오. 완전히 점성 유체 활액을 멀리 세척하기 위해, 우리는 37 ° C 배양기 (출렁 이는 주파수에 락을, 야간 chondrocyte 차별화 매체 (Lonza)로 세척하는 것이 가장 효과적인 발견 : 약 75 시간S / 분). chondrocyte 성장 매체는이 연장 씻어에서 chondrocyte 생존을 보장하고 고정 에이전트의 최대 침투를 허용하는 데 사용되었다.
  2. 야간 70 % 에탄올에 비즈를 수정하고, histological 분석 진행합니다. Dapi의 얼룩을 수행하려면, 부드러운 락을 미만 1 시간에 대한 Dapi 솔루션 (500ng/ml)와 알지네이트요 비즈를 품어, 15 분 102mM CaCl 2 때마다 3 번 씻는다. Dapi 이미지는 다음 형광 현미경으로 볼 수 있습니다. 구슬은 alcian 파란색과 H & E의 얼룩에 대한 sectioned 수 있습니다.

6. 대표 결과

활액 액체의 높은 비율 인간의 chondrocytes위한 3D culturing 방법은 Fig.1에 표시된 설계도 다이어그램에 그려져 있습니다. 인간 chondrocytes가 알지네이트요 비즈에서 캡슐 후에, 그들은 활액 액체의 비율을 변화와 보완 매체 성장할 수있었습니다. 때문에 활액 유체의 점도, 그것은하는 것이 필수적입니다문화 chondrocytes는 지속적인 락을 조건 아래에있는 연골 구조의 clumping을 방지하고 영양도 배포를 보장합니다. 이것은 고정 또는 용해 버퍼 (Fig.1) 비즈 침투 수 있도록 chondrocytes을 검색하기 전에 광범위하게 알지네이트요 비즈를 씻어도 필수적입니다. 알지네이트요 비즈의 chondrocytes의 명시야 (BF) 이미지 Fig.2에 표시됩니다. Dapi의 얼룩은 비즈 내에서 세포의 usniform 분포 (그림 2) 확인 수행되었다. 21 일 문화 기간의 끝에, 유전자 표현 분석 qRT - PCR에 의해 수행되었다. 그것이 chondrocytes 32 qPCR 분석을위한 가장 안정적인 레퍼런스 유전자 중 하나가 될하기로 결정했습니다로서 참조 유전자 GAPDH는 모든 PCRs에 대한 정상화를 위해 사용되었다. 예제는 그림에 표시됩니다. 우리가 관절염 여섯 환자에서 풀링된 활액 액체의 교양 인간의 관절 chondrocytes에서 결과를 분석 3. 사실과 일치와는 chondrocytesLonza는 불가피하게 취소 분화 33 이어질 것이 2D 문화에서 확장되었습니다, 우리는 그런 일 0 chondrocytes는 연골 매트릭스 유전자의 최소한의 수준 (그림 3) 표현 발견했습니다. 활액 액체로 보충 chondrocyte 차별화 매체 (Lonza)이나 매체 chondrocytes의 3D culturing 크게 날 21 일 (Fig.3) 34에 의해 다시 차별 chondrocyte을 나타냅니다 콜라겐, aggrecan 및 MMP13의 연골의 유전자 발현을 증가시켰습니다. 미디어의 활액 액체의 비율을 증가 시키면 연골 매트릭스 마커 콜라겐 II ​​및 aggrecan의 mRNA 발현 (Fig.3A 및 3B)의 비교 수준의 결과. 중간 혼자 (Fig.3C)에서 교양 이들과 비교뿐만 아니라, 100 % 활액 액체의 양식 chondrocytes도 연골 저하 효소 MMP13 mRNA 표현의 감소를 전시. 흥미롭게도, 세포 죽음이 표시 caspase 3의 표현 수준은 점차 제안, 활액 액체의 비율 증가와 함께 감소되는의ynovial 유체 culturing 감소 apoptosis 수준 (그림 3D)으로되었다. 따라서, 우리의 결과는 3D 환경에서 활액 액체 높은 수준의 culturing 인간의 관절 chondrocytes이 가능한 기술입니다 보여줍니다.

테이블과 피규어

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그림 1. 3D 알지네이트요 비즈의 활액 액체의 높은 비율의 문화 인간의 관절 chondrocytes에 대한 방법의 도식 다이어그램. 첫째, chondrocytes 및 알지네이트요 솔루션은 혼합 수 있습니다. CaCl 2 솔루션 드롭 현명 적용하면, chondrocytes는 가교 CA - 알지네이트요의 히드로겔 비즈 내에서 움직일 수 있습니다. 이러한 3D 구조는 다음 인간 활액 액체의 비율을 변화와 chondrocyte 차별화 매체 (Lonza)에 양식이 있습니다. 락을 조건 culturing 21 일 후에 세포를 포함하는 알지네이트요 비즈는 세포가 유전자에 대한 검색되는 이후에 광범위하게 씻어 아르표현 분석.

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그림 2. 브라이트 필드 (BF)와 인간의 관절 chondrocytes의 Dapi 이미지 0퍼센트, 30 %, 50 %, 70 % 및 100 % 활액 액체와 캡슐 문화. Chondrocytes 모든 문화 조건에서 모양 구형했다. 명시야 (BF)와 Dapi의 이미지는 chondrocytes의 위치와 분포를 확인하기 위해 입혔다했다. Insets, 확대 이미지를 표시합니다. 화살촉, BF와 Dapi의 얼룩 이미지의 chondrocytes의 colocalization.

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그림 3. 하루 캡슐 인간의 관절 chondrocytes의 qRT - PCR 분석 0 (D0) 활액 액체 (SF) (0 %, 30 %, 50 %, 70 다양한 비율로 보충 매체 culturing (D21) 21 일 후에 % 및 100 %). 네 독립 표본의 결과는 여기에 표시됩니다. GAPDH는 모든 PCRs에 대한 내부 참조로 사용되었다. . 콜라겐 II의 mRNA의 표현. B. Aggrecan의 mRNA의 표현. C. MMP13 mRNA의 표현. D. Caspase 3 mRNA의 표현. 통계 중요성은 일 0 샘플과 0 %의 주 21 샘플 및 INSTAT 소프트웨어를 사용 백퍼센트 활액 액체 (SF) culturing를 평가했다. * 나타냅니다 P <0.05.

토론

이 보고서에서는, 우리는 인간 활액 액체의 높은 농도를 포함 매체 3D 환경에서 인간의 관절 chondrocytes의 문화에 대해 수있는 방법을 개발했습니다. 활액 액체는 관절 chondrocytes이있는 공동 구멍에 자연 환경을 구성하는 주요 구성 요소 중 하나입니다. 그러나, 활액 유체의 점도는 chondrocytes의 세 차원 장기 culturing에 대한 큰 도전을했습니다. 3D 막아야 환경에서 구축하고 방지하기 위해 집계에서도 ?...

공개

우리는 공개 아무것도 없어.

감사의 말

우리는 활액 유체 저장 및 원심 분리와 도움을 제공하는 로빈 Nye (Tufts 의료 센터), Tomoya Uchimura와 다나 케언즈 (Tufts 대학)을 감사드립니다. 이 작품은 출발지에 대한 NIH (1R01AR059106 - 01A1)에 의해 추진하는 사업

자료

특정 시약 및 장비의 테이블 :

시약의 이름 회사 카탈로그 번호 댓글
알긴산 (Alginic 산성 나트륨 소금) 시그마 A2158 - 250G 2.4 % 용액은 40 ° C에 보관
염화칼슘 이수화물, 세분화된 JT 베이커 A19339
Chondrogenic 성장 미디어 Lonza CC - 3156 (기본 미디어)
CC - 4409 (보충)
Chondrogenic 차별화 미디어 Lonza CC - 3226 (기본 미디어)
CC - 4408 (보충)
인간 관절 chondrocytes Lonza CC - 2550
Dapi (4 ', 6 Diamidino - 2 - phenylindole의 dihydrochloride) 시그마 - 올드 리치 D9542
RNeasy 미니 키트 (RNA 추출을위한) Qiagen 74,104
PCR 시약 : SYBR 녹색 콴타 95053-500
12 ML의 주사기 Tyco - 켄달 - Monoject 512,852
22 - Gague의 피하 니들 Tyco - 켄더나 - Monoject 8881
현미경 올림포스 산 IX71
플랫폼 로커 Thermoscientific thermolyne Vari - 믹스
Primers 시퀀스
콜라겐 IIa - 앞으로 5' - TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT - 3 '
콜라겐 IIa - 역방향 5' - CCTCTGCCTTGACCCGAA - 3 '
MMP13 - 앞으로 5' - TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT - 3 '
MMP13 - 역방향 5' - AGA AGC 개그 CTT TGA GTC AT & T GCC - 3 '
Caspase 3 - 앞으로 5' - TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA - 3 '
Caspase 3 역 5' - TGG ATG AAC 편대의 편대 장의 개그 CCA TCC TTT의 -3 '

참고문헌

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