Un sistema 3D para los condrocitos articulares humanos cultivo de líquido sinovial

Resumen

Un sistema 3D de los condrocitos articulares humanos en cultivo de altos niveles de líquido sinovial se describe. El líquido sinovial refleja el microambiente más naturales para el cartílago articular, y puede ser fácilmente obtenido y almacenado. Así, este sistema puede ser utilizado para el estudio de la regeneración del cartílago y de terapias de detección para el tratamiento de la artritis.

Resumen

Destrucción del cartílago es una característica central patológicas de la artrosis, la principal causa de discapacidad en los EE.UU.. Cartílago en el adulto no se regenera de manera muy eficiente en vivo, y como consecuencia, conduce a la osteoartritis irreversible pérdida de cartílago y se acompaña de dolor crónico y ^1,2 inmovilidad. Ingeniería tisular del cartílago ofrece un potencial prometedor para regenerar y restaurar la función del tejido. Esta tecnología implica normalmente la siembra de los condrocitos en andamios natural o sintético y el cultivo de las 3D da como resultado la construcción en un medio equilibrado en un período de tiempo con el objetivo de la ingeniería bioquímica y un tejido maduro biomecánica que pueden ser trasplantados en un sitio de defecto en vivo ^3-6 . Lograr una condición óptima para el crecimiento de los condrocitos y la deposición de la matriz es esencial para el éxito de la ingeniería de tejido cartilaginoso.

En la cavidad de la articulación del cartílago nativo, en el árticocular la superficie del hueso está bañado en el líquido sinovial. Este líquido claro y viscoso, proporciona nutrientes al cartílago articular avascular y contiene factores de crecimiento, citoquinas y enzimas que son importantes para el metabolismo de los condrocitos ^7,8. Además, el líquido sinovial facilita el movimiento de baja fricción entre las superficies cartilaginosas, principalmente a través de secretar dos componentes clave, ácido hialurónico y lubricina ^{9 10.} En contraste, el cartílago de la ingeniería tisular es más a menudo cultivadas en medios artificiales. Si bien estos medios de comunicación es probable ofrecer condiciones más definido para el estudio del metabolismo de condrocitos, el líquido sinovial refleja con más precisión el entorno natural de que los condrocitos articulares residen pulg

De hecho, el líquido sinovial tiene la ventaja de ser fáciles de obtener y almacenar, ya menudo puede ser renueva constantemente por el cuerpo. Varios grupos han complementado el medio de cultivo de líquido sinovial en el crecimiento humano, conejo, bovino, y el perro chondrocytes, pero la mayoría utilizan bajos niveles de líquido sinovial (por debajo del 20%) ^11-25. Mientras que los condrocitos de pollo, caballo y humanos han sido cultivadas en el medio con mayor porcentaje de líquido sinovial, estos sistemas de cultivo de dos dimensiones ^26-28. A continuación les presentamos nuestro método de cultivo de condrocitos articulares humanos en un sistema 3D con un alto porcentaje de líquido sinovial (hasta el 100%) durante un período de 21 días. Al hacerlo, hemos superado un gran obstáculo presentado por la alta viscosidad del líquido sinovial. Este sistema ofrece la posibilidad de estudiar los condrocitos humanos en el líquido sinovial en un entorno 3D, que puede combinarse con otros dos factores importantes (la tensión de oxígeno y la carga mecánica) ^29,30 que constituyen el entorno natural de cartílago para imitar el medio natural para cartílago de crecimiento. Además, este sistema también puede ser utilizado para el ensayo de la actividad de líquido sinovial en los condrocitos y proporcionar una plataforma para el desarrollo deregeneración del cartílago tecnologías y opciones terapéuticas para la artritis.

Protocolo

Un sistema 3D para el cultivo de condrocitos articulares humanos en el líquido sinovial

En este trabajo, se encapsulan los condrocitos humanos articular en perlas de alginato usando una versión modificada de fabricación-sugirió la encapsulación de protocolo (Lonza, y ^31). El uso de estas construcciones en 3D, hemos desarrollado un sistema para el cultivo de células en un medio de cultivo que contienen porcentajes variaron de líquido sinovial humano y han evaluado estas construcciones 3D para la expresión de genes del cartílago.

1. Prepare los condrocitos humanos articular (HAC) de tres dimensiones (3D) en la encapsulación

1. Descongelar un vial (1 ml) de los condrocitos articulares humanos (HAC) (Lonza) (paso 2) en 37 ° C baño de agua durante 1 minuto.
2. Mezclar con 1 ml de medio de cultivo de condrocitos (Lonza) y se centrifuga a 3000 rpm durante 3-5 minutos para recoger las células. Eliminar el sobrenadante.
3. Resuspender el sedimento celular en los medios de crecimiento de los condrocitos (Lonza).
4. Células de la placa en un tejido de 10 cmplaca de cultivo (BD Biosciences), y la cultura en los medios de crecimiento de los condrocitos (Lonza) hasta que las células son confluentes. HAC debe ser utilizado en un número de paso no superior a 3 o 4 (P3 o P4).
5. Lave HAC en la placa de 155 mm con NaCl en lugar de la PBS estándar, seguido por trypsinzation para recoger las células para la encapsulación de alginato de cuentas. Una vez que las células se separan, la desaceleración de las células a 3000 rpm durante 5 minutos. Las células están listas para la encapsulación en 3D.

2. Encapsular HAC en cuentas en 3D

Resuspender el HAC en la solución de alginato de 1,2% (Sigma) a una densidad de 8x10 ⁵ células / ml. El número de células se determinó antes de la encapsulación, utilizando un contador de células estándar. Es muy importante mezclar bien para asegurar una distribución uniforme de las células en las cuentas.

1. Pipeta del HAC / mezcla de alginato solución a una jeringa de 12 ml conectada a una aguja de calibre 22 (Tyco Healthcare, Inc.).
2. Mientras tanto, prepare un vaso de 50 mL con 102 mM CaCl ₂ a 5 veces el volumen de la solución de HAC / aginate. Coloque una barra de agitación en el interior del vaso y los 102 mM _de CaCl2 solución lentamente (aproximadamente 150 rpm).
3. Sostenga la punta de la jeringa cerca de 6 pulgadas por encima de la superficie de la _solución de CaCl2 y agregue la mezcla de HAC / alginato en el gota a gota una solución de CaCl _2. En general, las perlas de alginato resultantes son de 2 mm de diámetro con una densidad de encapsulación de aproximadamente 10 ⁴ células / talón. Nota: La altura de la jeringa en la _solución de CaCl2 es importante. La distancia más corta se traducirá en forma de gota en vez de esférica en forma de bolas, haciendo que la integridad mecánica desigual y la encapsulación de células.
4. Deje que las cuentas revuelo en la _solución de CaCl2 durante 20-25 min. Mientras que otros protocolos de encapsulación alginato indican un tiempo de incubación mucho más corto de 10 minutos, se encontró que un mayor tiempo de incubación con la _solución de CaCl2 mejorado la integridad de la seanuncios.
5. Retire la _solución de CaCl2, lavar los granos 2-3 veces en 2-3 volúmenes de cloruro de sodio, y luego una vez en un medio de diferenciación de los condrocitos (Lonza). Mientras que otros protocolos de encapsulación alginato de cuentas involucran el uso de un filtro para los procedimientos anteriores de lavado, se encontró que las perlas de alginato a menudo quedan atrapados en el filtro y seco, lo que reduce la eficiencia de la encapsulación. Nos pareció que era más eficiente para permitir que los granos se depositen en el fondo del vaso antes de desechar la solución.
6. Utilice una espátula estándar para la transferencia de las cuentas en placas de cultivo. Por lo general, la cultura 12 cuentas por 3 cm y durante 2 días en medio de cultivo de condrocitos para permitir que los condrocitos para ajustar el proceso de encapsulación en el medio en que se cultivaron en medio antes de pasar a la diferenciación de condrocitos (Lonza) con el líquido sinovial.

3. Condrocitos de cultivo en medio líquido sinovial cultura

1. El líquido sinovial fresco se puede obtener de una oclínica utpatient (Se obtuvo líquido sinovial de Tufts Medical Center). El líquido sinovial se puede transferir en tubos Falcon de 15 ml para el laboratorio, e inmediatamente se centrifuga a 3000 rpm durante 15 minutos para eliminar los restos celulares. Alícuota de células libres de líquido sinovial en tubos de 1,5 mL microcentrífuga, para evitar repetidos de congelación-descongelación. Sobrenadante se almacenó a -80 º C hasta su uso.
2. Antes de cultivo, la mezcla del líquido sinovial con el medio de diferenciación de los condrocitos (MDL, Lonza) en diferentes proporciones en volumen, con una concentración constante de ácido ascórbico de 100 mm y 9 mm de _CaCl2 (esta cantidad mínima de _CaCl2 es asegurar la integridad del alginato cuentas).
3. Mantener la placa en una plataforma de mecerse en una incubadora de 37 ° C (frecuencia de oscilación: alrededor de 75 veces / min) para ayudar a la distribución de nutrientes dentro de las perlas de alginato, y para reducir la aglutinación de las bolas. Esto es especialmente importante a medida que la cultura los condrocitos durante un período prolongado de tiempo (hasta 4 semanas). Nota: Si bien el crecimiento de condrocitos y medio de diferenciación (Lonza) contienen dos antibióticos de uso común gentamicina y anfotericina, no complementar los antibióticos cuando se utilizan diferentes porcentajes de líquido sinovial para el cultivo de condrocitos. No se observó contaminación nunca.
4. Cambiar mezclas de medios cada 2-3 días. La viscosidad del líquido sinovial ha sido un obstáculo importante en el cultivo de condrocitos encapsulados en perlas de alginato en cultivos a largo plazo. Nos pareció que era más eficaz para diluir el líquido sinovial-medio suplementado con 102 mm de CaCl ₂ (50% V / V), que también fortalece la integridad de las perlas de alginato. De esta manera, el medio poco a poco se puede quitar con una pipeta, sin dañar los granos.

4. HAC cosecha en perlas de alginato para el análisis de expresión génica

Especial cuidado debe tenerse cuando se cosecha el HAC de las perlas de alginato para el análisis de expresión génica.

1. Lavar las perlas de alginato tres times en 102 mM CaCl ₂ durante 5 minutos cada vez.
2. Recuperar los condrocitos mediante la adición de 55 mM NaCitrate a un volumen 4.5 veces mayor que la de las cuentas. Es importante que las perlas de alginato están totalmente inmersos en la solución NaCitrate. Agitar o roca durante 20-30 min.
3. Centrifugar las células y se desecha el sobrenadante.
4. De análisis RT-PCR, resuspender el botón celular en tampón de lisis celular (Qiagen kit de aislamiento de ARN), y proceder a la purificación de ARN.

5. Fix HAC en perlas de alginato para el análisis histológico

Especial cuidado hay que tener para cosechar el HAC de las cuentas en 3D para su análisis histológico.

1. Lavar las perlas de alginato 3 veces en 102 mM CaCl ₂ durante 5 minutos cada vez. Para lavar completamente el líquido sinovial viscoso, nos pareció que era más eficaz para lavar con el medio de diferenciación de los condrocitos (Lonza) durante la noche, meciéndose en una incubadora de 37 ° C (frecuencia de oscilación: 75 horas / min). El medio de crecimiento de los condrocitos se utilizó para asegurar la supervivencia de los condrocitos en este lavado prolongado y para permitir la máxima penetración del agente de fijación.
2. Arreglar las cuentas en el 70% de etanol durante la noche, y proceder con el análisis histológico. Para llevar a cabo DAPI, incubar perlas de alginato con DAPI solución (500ng/ml) durante 1 hora en suave balanceo, y lavar 3 veces con 102 mm _de CaCl2 durante 15 minutos cada vez. Dapi imágenes se pueden observar bajo un microscopio de fluorescencia. Las cuentas también se puede seccionar de Alcian azul y tinción H & E.

6. Resultados representante

Nuestro método de cultivo de condrocitos humanos en 3D en un alto porcentaje de líquido sinovial se muestra en el diagrama esquemático se muestra en la Fig. 1. Después de los condrocitos humanos se concentraron en perlas de alginato, se les permitió crecer en un medio suplementado con diferentes proporciones de líquido sinovial. Debido a la viscosidad del líquido sinovial, que es esencial paracondrocitos cultivo bajo condiciones de balanceo constante para evitar la aglutinación de las construcciones de los cartílagos y para asegurar una distribución uniforme de los nutrientes. También es esencial para lavar las perlas de alginato ampliamente antes de recuperar los condrocitos, de modo que la fijación o tampón de lisis puede penetrar en las cuentas (Fig. 1). Campo claro (BF) las imágenes de los condrocitos en las perlas de alginato se muestra en la Fig. 2. DAPI se realizó para confirmar la distribución usniform de las células dentro de las perlas (Fig. 2). Al final del período de cultivo de 21 días, análisis de expresión génica se realizó mediante QRT-PCR. La referencia del gen GAPDH se utilizó para la normalización de todos los informes de terminación, ya que se determinó que era uno de los genes de referencia más fiable para el análisis de PCR cuantitativa en los condrocitos ^32. Un ejemplo se muestra en la fig. 3, donde se analizaron los resultados de los condrocitos articulares humanos cultivados en el líquido sinovial agrupados de seis pacientes con osteoartritis. De acuerdo con el hecho de que los condrocitos deLonza se han extendido en las culturas en 2D, lo que conduciría inevitablemente a la des-diferenciación ^{de 33 años,} encontramos que el día 0 condrocitos expresan niveles mínimos de genes de la matriz del cartílago (Fig. 3). Cultivo de condrocitos en 3D con el medio de diferenciación de los condrocitos (Lonza) o el medio suplementado con el líquido sinovial de manera significativa el aumento de expresión del gen del colágeno de cartílago, aggrecan y MMP13, lo que indica condrocitos volver a la diferenciación por el día 21 (Fig. 3) ^34. Aumentar el porcentaje de líquido sinovial en los medios de comunicación dio lugar a niveles comparables de la matriz del cartílago marcadores II de colágeno y la expresión de ARNm aggrecan (Fig.3a y 3B). Además, los condrocitos cultivados en el líquido sinovial, incluso el 100% mostraron una disminución en la expresión de ARNm de enzima que degrada el cartílago MMP13 en comparación con los cultivados en el medio solo (Fig.3C). Curiosamente, el nivel de expresión de la caspasa muerte celular indicador 3 disminuyó gradualmente con el aumento de ratios de líquido sinovial, lo que sugiere que scultivo de líquido ynovial ha llevado a niveles de disminución de la apoptosis (Fig. 3D). Por lo tanto, nuestros resultados muestran que el cultivo de condrocitos humanos articular en los altos niveles de líquido sinovial en un entorno 3D es una tecnología viable.

Tablas y Figuras

Figura 1. Diagrama esquemático del método de los condrocitos articulares humanos en la cultura un alto porcentaje de líquido sinovial en perlas de alginato 3D. En primer lugar, los condrocitos y la solución de alginato se mezclan. Cuando se aplica gota a gota a la _solución de CaCl2, los condrocitos se encuentran inmovilizados en las cuentas de hidrogel reticulado alginato de calcio. Estas construcciones 3D luego se cultivaron en el medio de diferenciación de condrocitos (Lonza) con proporciones variables de líquido sinovial humano. Después de 21 días de cultivo bajo condiciones de balanceo, perlas de alginato que contienen las células se lavan ampliamente después de que las células se recuperan para el genanálisis de la expresión.

Figura 2. De campo claro (BF) y las imágenes Dapi de los condrocitos articulares humanos culturas encapsulado con 0%, 30%, 50%, 70% y 100% del líquido sinovial. Condrocitos fueron de forma esférica en todas las condiciones de cultivo. Las imágenes de campo claro (BF) y DAPI se superponen para confirmar la ubicación y distribución de los condrocitos. Recuadros, imágenes ampliadas. Puntas de flecha, colocalización de los condrocitos en BF y las imágenes Dapi manchas.

Figura 3. QRT-PCR análisis de encapsulado condrocitos articulares humanos en el día 0 (D0) una después de 21 días de cultivo (D21) en un medio suplementado con diferentes proporciones de líquido sinovial (SF) (0%, 30%, 50%, 70 % y 100%). Resultados de cuatro muestras independientes se muestran aquí. GAPDH se utilizó como referencia interna para todos los ITP. A. Colágeno II expresión del ARNm. B. Aggrecan la expresión del ARNm. C. MMP13 expresión del ARNm. D. Caspasa 3 mRNA expresión. La significación estadística se evaluó por el Día 0 y Día de las muestras de 21 muestras de 0% y 100% del líquido sinovial (SF) el cultivo, el uso de software INSTAT. * Indica P <0,05.

Discusión

En este informe, hemos desarrollado un método que permite el cultivo de condrocitos articulares humanos en un entorno 3D en un medio que contiene altas concentraciones de líquido sinovial humano. El líquido sinovial es uno de los principales componentes que constituyen el entorno natural en la cavidad de la articulación, donde residen los condrocitos articulares. Sin embargo, la viscosidad del líquido sinovial ha sido un gran desafío para tres dimensiones a largo plazo el cultivo de condrocitos. Para superar el re...

Materiales

Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alginato (sal sódica del ácido algínico)	Sigma	A2158-250G	2.4% de solución de almacenado a 40 ° C
Cloruro de calcio dihidrato, Granular	JT Baker	A19339
Los medios de comunicación condrogénica crecimiento	Lonza	CC-3156 (base de los medios de comunicación)
		CC-4409 (con suplemento)
Los medios de comunicación condrogénica diferenciación	Lonza	CC-3226 (base de los medios de comunicación)
		CC-4408 (con suplemento)
Condrocitos articulares humanos	Lonza	CC-2550
DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole diclorhidrato)	Sigma-Aldrich	D9542
RNeasy mini kit (para la extracción de ARN)	Qiagen	74104
PCR reactivos: SYBR-verde	Quanta	95053-500
12 ml jeringa	Tyco-Kendall-Monoject	512852
22 Gague aguja hipodérmica	Tyco-Kendall-Monoject	8881
Microscopio	Olimpo	IX71
Plataforma oscilante	Thermolyne Thermoscientific	Vari-mix
Cebadores secuencias
Colágeno IIa-forward	5'-TTC ATC CCA CCC TCT AGT CAC-3 '
Colágeno II a invertir	5'-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3 '
MMP13-forward	5'-GCC TGT CTT CTT CAC ACA ACT GAC-3 '
MMP13-reverse	5'-GAG AGC AGA CTT TGA GTC TCA GCC-3 '
Caspasa-3 hacia adelante	5'-TTC TTA TCA AGG CCT GCC GTG GTA-3 '
Caspasa-3 inversa	5'-TGG ATG AAC CAG CCA GAG TCC TTT -3 '