使用具体远藤和exoglycosidases糖基化蛋白质的鉴定和表征

摘要

使用特定的糖苷酶，以消除通过SDS - PAGE的糖蛋白的糖是一种有价值的的方法来检测蛋白质样品聚糖修改初始糖生物学研究的是一个不错的选择。以下deglycosylation变化可以检测凝胶的流动性的变化或与多糖敏感的试剂染色。

摘要

此外共价连接的糖，糖基化，是一个重要的翻译后修饰的蛋白质，可以显着影响，如细 ​​胞粘附分子贩运，清关，和^信号转导1-4的过程。在真核生物中，在分泌途径中最常见的糖基化修改，增加共识，天门冬素剩余物（N -连接）;或在丝氨酸或苏氨酸残基（O型连锁）（图1 ）。在真核生物中是高度保守的N -聚糖合成的起始，而最终产品可以在不同物种间，组织，或蛋白质大大不同。有些聚糖保持未修改"（"高甘露糖N -糖链"），或在高尔基（" 复杂的N -糖链"）进一步处理。更大的多样性是O型聚糖，开始与一个共同的 N -乙酰半乳糖胺（半乳糖胺）残留在动物细胞中，但不同的低等^生物 1 。 耳鼻喉科">蛋白质的糖基化的详细分析本身就是一个领域，需要丰富的资源和专业知识，正确执行。然而，各种可用的酶，删除糖（糖苷）成为可能的糖基化的现状有一个总体思路在一个标准的实验室环境中的蛋白质，在这里我们说明分析模型糖蛋白糖苷酶的使用。重组人绒毛膜促性腺激素β（hCGβ）， 它带有两个N -糖链和四个^O型聚糖5，该技术只需要简单仪器和典型的消耗品，它可以很容易地适应多种糖蛋白样品的分析。

几种酶可用于并行研究的一种糖蛋白。 PNGase F是能够去除几乎所有类型的N -连接聚糖^6,7。 为 O -糖链，有没有可用的酶可以切割完整的低聚糖从日E蛋白的骨干。相反，O型聚糖修剪exoglycosidases一个短的核心，是那么容易由 O -糖苷酶删除。蛋白质Deglycosylation结构包含PNGase F，O -糖苷酶，神经氨酸酶（唾液酸），β1- 4半乳糖苷酶和β- N - Acetylglucosaminidase。它是用来同时去除N -糖链和一些O型聚糖^8。最后，Deglycosylation混合补充的其他exoglycosidases混合物（α- N - Acetylgalactosaminidase，α1- 2岩藻糖苷酶，α1- 3，6半乳糖苷酶，β1- 3半乳糖苷酶），这有助于消除否则抗单糖，可目前在某些O -聚糖。

SDS-PAGE/Coomasie蓝色是用于可视化蛋白质迁移糖苷酶治疗前后的差异。此外，糖特定的染色方法，ProQ翡翠- 300，显示减少信号聚糖是帅客ssively删除。此协议是专为少量的糖蛋白（0.5％到2微克）的分析，虽然酶deglycosylation可以扩大规模，以适应需要较大的蛋白质数量。

研究方案

1。酶法deglycosylation

1. 使用PCR管中，以尽量减少因蒸发的水分流失。一个标签设置管1至7。
2. 解冻10X G7的缓冲区，10X糖蛋白变性缓冲，和10％的NP - 40，并轻轻拍打管混合的内容。保持室温。
3. 含酶的样品瓶置于冰上。尽量减少解冻/冻结周期。
4. 溶解于600μLDH _{2 OhCGβ}小瓶（150微克）的内容，并保持在冰上。
5. DH _{2 O}稀释10倍的股票，准备1毫升的1X G7的缓冲区
6. 0.5μLPNGase F稀释25μL1X G7的缓冲区，并保持在冰上。
7. 结合α- N - Acetylgalactosaminidase每2μL，α1- 2岩藻糖苷酶，β1- 3半乳糖苷酶和α1- 3，6半乳糖苷酶的准备exoglycosidase组合（如混合）。
8. 设置PCR管所示:

AK">

管/样品＃	1	2	3	4	5	6	7
hCGβ（0.25mg/ml）	9μl	9μl	9μl	9μl	-	-	-
10X糖蛋白变性缓冲	加入1μl	加入1μl	加入1μl	加入1μl	加入1μl	加入1μl	加入1μl
DH 2 O	-	-	-	-	9μl	9μl	9μl

9. 第管，轻轻混匀并放置在热循环，盖上盖子，变性的蛋白质，94孵育10分钟° C，4 ° C持有（使用PCR管在热循环，极大地防止蒸发，体积小样本）。
10. 删除从热循环管和离心机，以消除任何可见凝结。
11. 表示添加下列试剂:

样品＃	1	2	3	4	5	6	7
10％NP - 40	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl
10X G7的缓冲区	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5＆万亩;升	2.5μl
PNGase F 1:50 DIL。	-	2μL	-	-	2μL	-	-
Deglycosylation混合	-	-	2μL	2μL	-	2μL	2μL
乙二醇混合	-	-	-	2μL	-	-	2μL
DH 2 O	加入10μl	8μl	8μl	6μl	8μl	8μl	6μl
反应总卷。	25μ升	25μ升	25μ升	25μL	25μ升	25μ升	25μ升

12. 关闭使用新帽（丢弃用过的，因为他们不适合一个孵化周期后）的PCR管。
13. 混合管轻轻拍打的4倍，然后旋转内容。
14. 放置在热循环，并培育管在37 ° C 4小时，然后冷却至4 ° C的样品

2。 deglycosylated样品的SDS - PAGE

1. 准备加入4μL1.25M的DTT 130μL新鲜3X还原SDS上样缓冲液。
2. 每个样品中加入12.5μL减少准备3X SDS上样缓冲液。
3. 管关闭，新的警帽，并轻轻拍打管混合。
4. 孵育94℃，5分钟，然后冷却至4 ° C的热循环管
5. 装入每个样品30μL和10μL在10-20％Tris -甘氨酸凝胶蛋白标记。除部分3.1样品的其余部分。加载中加入10μlColorPlus预染蛋白Marker。
6. Electrophorese在室温下凝胶在130伏，直至染料前端接近凝胶底部。
7. 当凝胶运行完毕后，删除自投凝胶，放置在一个小塑料盒与足够的Coomasie蓝染色覆盖凝胶。
8. 凝胶染色，轻轻搅拌1小时。
9. destain解决方案在50毫升的凝胶三次洗为30分钟。
10. 使用白色的光透射或扫描仪记录图像。另外，干凝胶可在一帧之间的玻璃纸张。

3。临- Q翡翠检测糖化蛋白SDS - PAGE凝胶300

1. 2.1凝胶）的同时，负载在10-20％Tris -甘氨酸凝胶，其余样品。负载10＆万亩; ColorPlus预染蛋白Marker升。
2. 虽然凝胶是运行溶解DMF PRO - Q翡翠试剂和准备股票的修复，清洗和氧化性解决方案为300 PRO - Q翡翠染色以下产品与试剂盒提供的手册。
3. 电泳完成后，取出凝胶和从投它放置在一个塑料盒。
4. 修正加入100毫升的修复方案，并留在室温下轻轻摇动过夜的凝胶。
5. 100毫升的洗涤液10至20分钟，在室温詹蒂莱鼓动清洗凝胶。重复用新鲜的洗涤液洗。
6. 轻轻摇动孵育30分钟，在氧化溶液25毫升凝胶氧化碳水化合物。
7. 步骤3.5中所述的凝胶洗净。
8. 凝胶洗涤准备的Pro - Q翡翠300试剂在步骤3.2至25 ml溶解的解决方案中加入500μL新鲜的PRO - Q 300翡翠染色染色试剂盒中提供的缓冲区。
9. 凝胶染色加入25毫升的步骤3.8准备污渍和潜伏在黑暗中轻轻摇动90至120分钟。
10. 重复步骤3.5中所描述的两个洗步骤。
11. 记录在300nm的紫外透射图像。使用80 kDa的标记标示，这是与临 - Q翡翠绿，紫外线图像重叠到白光图片显示预染阶梯的凝胶。
12. 比较Coomasie染色凝胶的Pro - Q翡翠染色凝胶步骤3.11 2.10步的图像。

4。代表性的成果

在蛋白质酶deglycosylation后迁移的变化如图2所示。比较对照样品（A组，泳道1）PNGase F治疗（去除N -糖链，2车道），和Deglycosylation混合（PNGase F，再加上远藤和exoglycosidases 取下 O -聚糖，车道3）。没有进一步减少（4车道）额外糖苷酶消化后的大小。除了大规模的变化，乐队变得更加清晰，为聚糖被删除。 A频段的17 kDa的标记（星号）下运行完全deglycosylatedhCGβ多肽（分子量:16 kDa）的代表。其他乐队可能来自不完全deglycosylation，或从多个身份不明的hCGβ样品中的蛋白质（见1巷）。 5日至7车道（对照组），显示相应的糖苷酶的乐队。

翡翠绿的糖蛋白染色显示面板B.此试剂氧化和污渍的一种蛋白质分子中存在的所有聚糖。因此信号强度下降hCGβ是酶deglycosylated（巷1号至4车道）。泳道3和4的剩余信号，表明聚糖的图案，所使用的酶有抗药性的存在。 4车道使用额外的糖苷酶，删除了一些额外的糖残基:蛋白质的迁移是相同的，但可以看出，在强度略有减少染色。抗糖基是目前在所有的蛋白质种类:翡翠绿（缺席的紫外线图像，括号内），说明他们广泛deglycosylated的某些频带均未检出。额外的数据支持hCGβ不均匀糖化的结论。低频段巷2号（箭头）是淡淡的翡翠的绿色形象，而2巷上带是光明的，表明许多聚糖组仍然存在。这些数据支持这样的结论，在小鼠细胞中表达的重组hCGβ包含^多个 glycoforms 9。延长，而这些不同glycoforms由于一些多肽没有收到在每共识网站和/或一些聚糖聚糖的糖基化的内在异质性的人即使在相同的蛋白质不。

图1。典型的分泌或细胞表面的糖蛋白糖基化模式。

图2 SDS - PAGE凝胶酶deglycosylationhCGβ。 A组显示一个Coomasie蓝染色，而B组临- Q翡翠300糖化蛋白的可视化结果。样品编号:1，hCGβ控制; 2，PNGase F消化; 3，Deglycosylation混合消化; 4，Deglycosylation Mix Plus的exoglycosidases消化，样品5至7试剂控制（O型，O型糖苷酶甘油; GNA，β- N Acetylglucosaminidase;加仑/ FUC，β1- 3半乳糖苷酶，α1- 3，6半乳糖苷酶和α1- 2岩藻糖苷酶; GalNA，α- N - Acetylglalactosaminidase;神经，神经氨酸酶; PNGase PNGase F）

讨论

这里介绍的方法使用酶deglycosylation和SDS - PAGE可以提供有价值的信息有关的蛋白糖基化状态，而聚糖特定试剂方便对数据的解释。此协议的目的是为蛋白质糖基化的初步研究，它特别适用于哺乳动物细胞分泌和膜糖蛋白:在这种情况下选择的酶将专门删除所有的 N -糖链， 或N -糖链加上最常见的糖扩大和形成的 O -糖链的核心。糖苷酶具有额外的优势正在温和，用化学deglycosylation方法相比，保持糖和蛋白质的骨干的完整性。

为了阐明入住率（氨基酸是糖化），糖基化的程度，或确定的精细结构的多聚糖，更先进的技术，如米屁股光谱仪，液相色谱仪或核磁共振是必需的。

由于其简单，在这个协议中的几个步骤可以进行调整，替换，和/或合并，以适应不同的实验需要。然而，为了获得结果，可以清楚地解释重要的是要了解它的长处和局限性。首先，特异性和糖苷酶的纯度是至关重要的:只有良好的特点测试蛋白酶和其他污染活动的酶，应使用。不幸的是，没有标准的单位定义为糖苷酶，根据制造商的规格，用户应确定适当的替代。二，谨慎选择的检测是必要的:A）蛋白染色试剂是有用的，只有在一个相对分子质量的重大转变的deglycosylation结果。并不总是得到这样一个明确的结果如下所示。在其他情况下，我们所看到的异常MIdeglycosylation后格拉逊（远远低于预测的分子量，或更慢迁移） 。这种现象是没有很好地理解，但也可以说， 任何在迁移变化是证据表明，该蛋白已deglycosylated B）糖与抗体检测呈现独特的挑战限制其适用性。它已经很难产生一般反聚糖抗体，它们通常是对一个复杂的糖链的目标，这限制了它们的使用提出。此外，一些单克隆抗聚糖抗体显示不受欢迎的交叉^反应 10。彗星）凝集素（糖亲和力内在蛋白）是非常适合对糖的检测，加上他们给聚糖结构上的洞察力。然而，并非所有这些有一个狭窄的特异性，很多都只是部分的特点（这意味着他们可能有未知的亲和力）。因此积极的外源凝集素染色提供指示，而不是地理标志的存在证明，VEN糖D）化学标记试剂盒（基于碘酸氧化糖）的首选方法染色所有的糖蛋白，因此非常适合跟随deglycosylation。

处理未知样品时，这是一个很好的做法，包括糖蛋白控制。胎球蛋白是一个现成的N - 和 O -糖蛋白，绒毛膜促性腺激素（两个亚基）也是一个不错的选择。牛血清白蛋白（BSA）可以用来作为阴性对照。但是，应该指出，一些非糖基化蛋白反应轻微的Pro - Q 300翡翠，特别是在高浓度时使用。非糖基化的分子量标准，如在本议定书中使用的预染蛋白质标记，显示锐利带的优势。不仅是这些蛋白质（80 kDa）的反应到临 - Q翡翠300之一的机会。因此，用户可能要运行的一种糖蛋白标准的阶梯，而不是，如Invitroge糖甘蔗N.

最后，简单的凝胶nucleocytosolic糖蛋白（这是一个单一的O型葡萄糖修改）的检测是可能的使用单克隆抗体，沿β- N - Acetylglucosaminidase ^特异性控制11。超越了这项技术的描述是这篇文章的范围，但它应该提到糖苷酶在细胞中存在的许多其他糖蛋白和糖复合物的研究是非常有用的工具。一个所有已知的糖基化形式的综合治疗，可以发现在第二版的"糖生物学基础"，可在NCBI的书柜（书架编号:;:20301239关键词^NBK1908）免费在线12。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
人绒毛膜促性腺激素β	西格玛爱秩序	C6572
PCR管	VWR	20170-004
PCR扩增热循环仪	应用生物系统公司	4359659
PNGase F	New England Biolabs公司	P0704	提供与缓冲区
蛋白质Deglycosylation组合	New England Biolabs公司	P6039	提供与缓冲区
α- N - Acetylglalactosaminidase	New England Biolabs公司	P0734	提供带缓冲
α1- 2岩藻糖苷酶	New England Biolabs公司	P0724	提供带缓冲
α1- 3，6半乳糖苷酶	New England Biolabs公司	P0731	提供带缓冲
β1- 3半乳糖苷酶	New England Biolabs公司	P0726	提供带缓冲
10X缓冲G7（500 mM磷酸钠）	New England Biolabs公司	---	提供与PNGaseF或Degl混合
10X糖蛋白变性缓冲液（5％SDS，400毫米数码地面电视）	New England Biolabs公司	---	提供与PNGaseF或Degl混合
10％NP - 40	New England Biolabs公司	---	提供与PNGaseF或Degl混合
3X SDS上样缓冲液（187.5毫米的Tris - HCl pH值6.8，6％SDS，30％甘油，0.03％溴ophenol蓝色）	New England Biolabs公司	B7703	提供与1.25M数码地面电视
ColorPlus预染蛋白Marker	New England Biolabs公司	P7709
10-20％的Tris -甘氨酸Multigel	丽悦生物有限公司	DCB - 414893
盒式电​​泳单元	丽悦生物有限公司	DCB - 303111
电泳电源的EPS 301	GE医疗集团	18-1130-01
临- Q翡翠300糖蛋白染色试剂盒	Invitrogen公司	P - 21857
艳蓝R	西格玛爱秩序	B0149
AlphaImager惠普系统	细胞生物科技公司	92-13823-00