Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

Özet

SDS-PAGE ile takip glikoproteinler şekerler kaldırmak için belirli glycosidases kullanarak protein örnekleri üzerinde glukanıdır değişiklikler tespit etmek için değerli bir yöntemdir ve ilk Glikobiyoloji çalışmaları için iyi bir seçimdir. Deglycosylation aşağıdaki değişiklikler, jel hareketlilik vardiya olarak veya glukanıdır duyarlı reaktifler boyama ile tespit edilebilir.

Özet

Glikozilasyon, kovalent bağlarla bağlanmış şekerlerin yanı sıra, proteinlerin hücre adezyon, moleküler kaçakçılığı, gümrükleme, ve sinyal iletimi ^1-4 gibi süreçleri önemli ölçüde etkileyebilir post-translasyonel önemli bir değişiklik . Veya serin veya treonin artıkları (O bağlantılı) (Şekil 1); ökaryotlar, salgı yolağı en yaygın glikozilasyon değişiklikler konsensüs asparajin artıkları (N-bağlantılı) ilave. N-glukanıdır sentezinin başlatılması son derece farklı türler, doku veya protein son ürünleri arasında çok büyük farklılıklar ise, ökaryotlarda korunur . Bazı değiştirilmemiş glukanlardır ("yüksek mannoz K-glukanlardır") ya da daha fazla Golgi ("karmaşık K-glukanlardır") işlenir kalır. Hayvan hücrelerinde ortak bir N-Acetylgalactosamine (GalNAc) kalıntı ile başlar ama daha aşağı organizmalardan ¹ farklı O-glukanlardır, büyük çeşitlilik bulundu. ent "> kendi başına bir alan proteinlerin glikozilasyon detaylı analiz ve doğru çalışabilmesi için geniş kaynaklar ve uzmanlık gerektirir. kaldır şekerler (glycosidases) glikozilasyon durumu hakkında genel bir fikir mümkün kılan mevcut enzimlerin Ancak çeşitli Burada standart bir laboratuar ortamında bir protein analizi için bir model glikoprotein glycosidases kullanımı göstermektedir: iki K-glukanlardır ve dört O glukanlardır ⁵ taşıyan rekombinant insan koryonik gonadotropin beta (hCGβ), tekniği, sadece basit gerektirir enstrümantasyon ve tipik ve sarf malzemeleri, birden fazla glikoprotein örnekleri analiz için kolayca adapte edilebilir.

Bazı enzimler bir glikoprotein çalışma paralel olarak kullanılabilir. PNGase F N-bağlı glukanlardır ^6,7 hemen hemen her türlü kaldırmak mümkün. O-glukanlardır için bir enzim yoktur tutunmaya th sağlam bir oligosakkarite protein omurgası. Bunun yerine, O-glukanlardır kısa bir çekirdek, sonra O-Glycosidase kolayca kaldırılır exoglycosidases tarafından kesilmiş bulunmaktadır. Protein Deglycosylation Mix PNGase Nöraminidaz F, O Glycosidase, (sialidase), β1-4 galaktosidaz ve β-N-Acetylglucosaminidase içerir. Aynı anda K-glukanlardır ve bazı O-glukanlardır ⁸ kaldırmak için kullanılır. Son olarak, Deglycosylation Mix, aksi takdirde mevcut olabilir dayanıklı Monosakkaritler kaldırmanıza yardımcı diğer exoglycosidases bir karışımı (6 galaktosidaz α1-3, α1-2 Fucosidase, α-N-Acetylgalactosaminidase, β1-3 galaktosidaz) ile tamamlanıyor belirli Ç glukanlardır.

SDS-PAGE/Coomasie mavi glycosidase tedavi öncesi ve sonrası protein göç farklılıkları görselleştirmek için kullanılır. Glukanlardır succe Buna ek olarak, şeker özel bir boyama yöntemi, ProQ zümrüt-300, azalmış sinyal gösterirssively kaldırıldı. Bu protokol, enzimatik deglycosylation gerektiği kadar büyük miktarlarda protein karşılamak için ölçeklendirilebilir, ancak küçük miktarlarda glikoprotein (0,5-2 mg) analizi için tasarlanmıştır.

Protokol

1. Enzimatik deglycosylation

1. Buharlaşma nedeniyle su kaybını en aza indirmek için PCR tüpleri kullanın. Etiket bir set borular 1 7.
2. Çözülme, 10X, G7 tampon, 10X glikoprotein denatüre tampon, ve% 10 NP-40 ve tüpler içeriğini karıştırmak için hafifçe dokunun. Oda sıcaklığında tutun.
3. Buz üzerinde enzim içeren flakon yerleştirin. Erime / donma döngüleri en aza indirmek için deneyin.
4. Ul dH ₂ O 600 (150 mikrogram) hCGβ flakon içeriği çözülür ve buz üzerinde tutmak.
5. DH ₂ O 10X stok seyreltilmesi 1 ml 1X G7 tampon hazırlayın
6. 25 ul 1X G7 tampon PNGase F 0.5 ul seyreltilir ve buz üzerinde tutmak.
7. 2 ul α-N-Acetylgalactosaminidase her α1-2 Fucosidase, β1-3 galaktozidaz, ve α1-3, 6 galaktosidaz birleştirerek exoglycosidase (EG karışımı) karışımı hazırlayın.
8. PCR tüpleri belirtildiği gibi ayarlayın:

ak ">

Boru / örnek #	1	2	3	4	5	6	7
hCGβ (0.25mg/ml)	9μl	9μl	9μl	9μl	-	-	-
10X Glikoprotein Tampon denatüre	1μl	1μl	1μl	1μl	1μl	1μl	1μl
dH 2 O	-	-	-	-	9μl	9μl	9μl

9. Tüpler kapağı, hafifçe karıştırın ve yerPCR, kapağını kapatın ve 94 az 10 dakika inkübe proteinler denatüre ° C 4 ° C tutun takip (PCR PCR tüpleri kullanılarak büyük ölçüde küçük hacimli örnekleri buharlaşmasını önler).
10. PCR tüpleri çıkarın ve görünür bir yoğunlaşma kaldırmak için santrifüj.
11. Belirtildiği gibi aşağıdaki reaktifler ekleyin:

Örnek #	1	2	3	4	5	6	7
% 10 NP-40	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl
10X G7 Tampon	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5 ve mu; L	2.5μl
PNGase F 1:50.	-	2μl	-	-	2μl	-	-
Deglycosylation Mix	-	-	2μl	2μl	-	2μl	2μl
EG karışımı	-	-	-	2μl	-	-	2μl
dH 2 O	10μl	8μl	8μl	6μl	8μl	8μl	6μl
Toplam reaksiyon vol.	25 μ l	25 μ l	25 μ l	25 μ l	25 μ l	25 μ l	25 μ l

12. Yeni kapaklar (bir inkübasyon döngüden sonra düzgün uymaz bu yana kullanılan at) kullanılarak PCR tüpleri kapatın.
13. 4 kez hafifçe dokunarak ve ardından içeriğini aşağı doğru döndürün tüpler karıştırın.
14. 37 ° C, 4 saat sonra 4 ° C'ye kadar örnekleri serin termalcycler ve inkübe tüpleri yerleştirin

2. Deglycosylated örneklerin SDS-PAGE

1. 4 ul 1,25 DTT ekleyerek 130 ul taze 3X azaltarak SDS yükleme tamponu hazırlayın.
2. Her bir örnek için hazırlanan 3X azaltarak SDS yükleme tamponu 12.5 ul ekleyin.
3. Yeni kapaklarla kapatın ve tüpler tüpler karıştırmak için hafifçe dokunun.
4. 94 bir PCR tüpleri inkübe ° C 4 ° C'ye kadar serin sonra 5 dakika
5. Her numunenin 30 ul ve% 10-20 Tris-Glisin jel protein marker 10 ul yükleyin. Geri kalan kısmı 3.1 için örnek kaydedin. ColorPlus Prestained Protein Marker 10μl yükleyin.
6. 130 volt boya ön alt jel yakın olduğu kadar oda sıcaklığında jel Electrophorese.
7. Jel çalışması tamamlandığında, jel dökme kaldırmak ve yeterli Coomasie mavi jel kapsayacak şekilde leke küçük bir plastik kutu içine koyun.
8. 1 saat yavaşça sallanarak jel Leke.
9. Destain çözüm 50 ml, 30 dakika boyunca jel üç kez yıkayın.
10. Beyaz bir ışık transilluminator'de veya tarayıcı kullanarak görüntüleri kaydedin. Alternatif olarak, bir çerçeve içinde selofan yaprak arasında jel kurulanmalıdır.

3. Pro-S Zümrüt 300 glikozile proteinler SDS-PAGE jel tespiti için

1. 2.1 'de jel) ile paralel olarak,% 10-20 Tris-Glisin jel örneklerinin kalanı yükleyin. Yük 10 & muL ColorPlus Prestained Protein Marker.
2. DMF ile jel Pro-Q zümrüt reaktif çözülür ve stok Fix, yıkayın hazırlamak çalışan ve Pro-S Zümrüt 300 için çözümler Oksitleyici iken kiti ile sağlanan ürün kılavuzuna aşağıdaki leke.
3. Elektroforez tamamlandığında, dökme jel çıkarın ve bir plastik kutu içine koyun.
4. Fix çözüm 100 ml ekleyerek ve oda sıcaklığında yavaşça sallanarak o gecede terk jel sabitleyin.
5. Yıkama çözüm gentile ajitasyon ile oda sıcaklığında 10 ila 20 dakika için 100 ml jel yıkayın. Taze Yıkama solüsyonu ile yıkama işlemi tekrarlayın.
6. Çözüm Oksitleyici 25 ml 30 dakika boyunca yavaşça sallanarak jel kuluçka karbonhidratlar okside.
7. Adım 3.5 'te açıklandığı gibi jel yıkayın.
8. Jel, 500 ul adım 3.2 'de 25 ml çözünmüş Pro-Q Emerald 300 reaktif çözüm ekleyerek taze Pro-Q Emerald 300 leke hazırlamak yıkamatampon boyama kiti sağlanan.
9. Leke leke adım 3.8 'de hazırlanan 25 ml ekleyerek ve 90 ila 120 dakika boyunca yavaşça sallanarak karanlıkta inkübe jel.
10. Adım 3.5 'te açıklanan iki yıkama adımları tekrarlayın.
11. 300nm UV transilluminator'de görüntüleri kaydedin. Pro-Q Zümrüt Yeşili ile etiketli 80 kDa işaretleyici, jel prestained merdiven gösteren bir beyaz ışık resmi UV görüntü üst üste kullanın.
12. Adım adım 3.11 Pro-Q zümrüt boyanan jel ile 2.10 'da Coomasie lekeli jel görüntüleri karşılaştırın.

4. Temsilcisi sonuçları

Enzimatik deglycosylation sonra protein göç değişiklikler Şekil 2'de gösterilmiştir. PNGase F tedavi (N-glukanlardır kaldırılması, şerit 2) ve Deglycosylation Mix (artı endo-ve O-glukanlardır kaldırmak için exoglycosidases şeritli 3 PNGase F) (panel, şerit 1) kontrol örneği karşılaştırın. Daha fazla azalmaboyutu ek glycosidases (şeritli 4) sindirerek sonra görülür. Glukanlardır kaldırılır gibi kitlesel bir değişimin yanı sıra, bant sertleşti. 17 kDa işaretleyici (yıldız) altında çalışan bir grubun tamamen deglycosylated hCGβ polipeptid (16 kDa MW) temsil eder. Diğer bantlar, eksik deglycosylation veya hCGβ örnek mevcut çok sayıda tanımlanamayan proteinler (şeritli 1) kaynaklanıyor olabilir. Lanes 5 ila 7 (kontroller) glycosidases karşılık gelen bantları göstermektedir.

Zümrüt Yeşili glikoprotein boyama Bu reaktif bir protein molekülünün tüm glukanlardır oksitler ve lekeleri, panel B'de gösterilmiştir. Bu nedenle hCGβ enzimatik (şeritli 4 şeritli 1) deglycosylated olarak sinyal şiddeti azalır. 3 ve 4 şeritli artık sinyal kullanılan enzimler dayanıklı glukanıdır motifler, varlığını gösterir. Protein göç aynıdır, ancak ek glycosidases 4 şeritli olarak kullanılan bir kaç ekstra şeker artıklarını ortadan kaldırırboyanma şiddeti hafif bir azalma görülebilir. Dayanıklı şeker moieties bütün protein türlerinin mevcut değildi: yoğun deglycosylated gösteren bazı gruplar, Zümrüt Yeşil (UV görüntü yok, parantez içinde) tarafından tespit edilmedi. Ek veri hCGβ heterojen glikozile olduğu sonucuna destekler. 2 şeritli üst bant birçok glukanlardır gruplar hala mevcut olduğunu gösteren, aydınlık ise daha düşük bant şeritli 2 (ok), Zümrüt Yeşili görüntü soluk. Bu veriler, fare hücrelerinde ifade rekombinant hCGβ birden fazla ^glycoforms 9 içerdiğini sonuca destek . Hatta aynı protein diğerleri ise bu farklı glycoforms bazı polipeptidlerin her fikir birliği sitesi ve / veya bazı glukanlardır glukanıdır almazlar glikozilasyon doğasında heterojenite nedeniyle genişletilmiş.

Şekil 1.Tipik salgılanan ya da hücre-yüzey glikoprotein glikozilasyon desenler.

HCGβ enzimatik deglycosylation gösteren Şekil 2 SDS-PAGE jeller. Panel A, B Paneli glikozile proteinler görünüm için Pro-Q Emerald 300 sonuçları gösterirken, bir Coomasie mavi boyanma gösterir. Örnek sayısı: 1, hCGβ kontrolü; 2, PNGase F sindirim, 3, Deglycosylation Mix sindirim; 4, Deglycosylation Mix artı exoglycosidases sindirim, numuneler 5 ila 7 (O-Glyc, O-Glycosidase reaktif kontrolleri; TBMM, β-N Acetylglucosaminidase; Gal / sikişi, β1-3 galaktosidaz, α1-3, 6 galaktozidaz, ve α1-2 Fucosidase; GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase; Neu Nöraminidaz; PNGase PNGase F)

Tartışmalar

Glukanıdır özel reaktifler verilerin yorumlanmasını kolaylaştırır yöntemi, enzimatik deglycosylation ve SDS-PAGE ile ilgi bir protein glikozilasyon durumu hakkında değerli bilgiler sağlayabilir Burada anlatılan. Bu protokol, protein glikozilasyon ilk çalışmaları için tasarlanmıştır ve özellikle memeli hücrelerinin salgı ve membran glikoproteinler için uygundur: Bu durumda seçilen enzimler özellikle N-glukanlardır kaldırmak ve N-glukanlardır artı ve en yaygın şekerler uzanan ve O-glukanlardır çekirdeğini oluşturan. Glycosidases hem de şeker ve protein omurga bütünlüğünü koruyarak, kimyasal deglycosylation yöntemlerle karşılaştırıldığında, hafif olmanın bir diğer avantajı var.

Doluluk oranı (hangi amino asitler glikozile), glikozilasyon kapsamı, ya da ince yapısı, glukanlardır m gibi daha sofistike teknikleri belirlemek için aydınlatmak içinass spektrometresi, sıvı kromatografisi veya NMR gereklidir.

Sadeliği nedeniyle, bu protokolü birkaç adımda ayarlanabilir, değiştirilemez ve / veya çeşitli deneysel ihtiyaçlarını karşılamak için kombine edilebilir. Ancak, açıkça yorumlanabilir sonuçlar elde etmek için güçlü ve sınırlamaları anlamak önemlidir. Birincisi, glycosidases özgüllüğü ve saflığı çok önemlidir: proteaz ve diğer bulaşıcı faaliyetleri ücretsiz olarak test sadece iyi karakterize enzimler kullanılmalıdır. Ne yazık ki, glycosidases için standart bir enzim birimi tanımı vardır; kullanıcı üreticinin özelliklerine göre uygun bir ikame belirlemelidir. İkincisi, tespit dikkatli bir seçim gereklidir: a) Protein boyama reaktifleri yararlıdır sadece moleküler kütlesi önemli bir vardiyada deglycosylation sonuçları. Böyle kesin bir sonuç, burada gösterildiği gibi, her zaman elde değil. Diğer durumlarda, anormal mi gördükdeglycosylation sonra biçimde entegre (tahmin molekül ağırlığı, hatta yavaş göç çok). Bu fenomen iyi anlaşılmış değildir, fakat göç herhangi bir değişiklik protein deglycosylated olduğunu kanıtlar olduğunu b) antikorları ile Şeker algılama uygulanabilirliğini sınırlayan benzersiz zorluklar sunuyor söylenebilir. Genel anti-glukanıdır antikorları üretmek için çok zor olmuştur, genellikle bunların kullanımı kısıtlayan karmaşık bir glukanıdır hedef, karşı yetiştirilir. Ayrıca, çeşitli anti-glukanıdır monoklonal antikorlar istenmeyen çapraz reaktivite ¹⁰ gösterir. C) Lektinler (içsel şeker afinite ile proteinler) ve şeker tespiti için uygundur, artı glukanıdır yapısı hakkında fikir vermek. Ancak, tüm bunların dar bir özgüllük ve birçok sadece kısmen (bilinmeyen yakınlık olabilir anlamına) karakterize edilir. Bir sonucu pozitif lektin boyama gi varlığının göstergesi değil, dayanıklı, sağlarven şeker d) Kimyasal etiketleme kitleri (şekerler periyodat oksidasyon dayalı) Tüm glikoproteinler leke için tercih edilen bir yöntemdir ve bu nedenle de deglycosylation takip etmek uygundur.

Bilinmeyen bir örnek işlerken, glikoprotein kontrolleri de iyi bir uygulamadır. Fetuin hazır bir N-ve O-glikoprotein koryonik gonadotropin (her iki alt birimden) de iyi bir seçimdir. Sığır serum albumin (BSA), negatif kontrol olarak kullanılabilir. Ancak, bazı non-glikolize proteinler yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığında, özellikle Pro-Q Emerald 300 ile biraz tepki dikkate alınmalıdır. Bu protokolde kullanılan prestained protein marker olarak non-glikolize moleküler ağırlık standartları, keskin bantları görüntüleme avantajı var. Sadece şans eseri bu proteinlerin (80 kDa), Pro-Q Emerald 300 reaktif biridir. Bu nedenle, kullanıcı gibi Invitroge Şeker Kamışı gibi bir glikoprotein standart merdiven yerine çalıştırmak için isteyebilirsinizn.

Son olarak, ¹¹ özgüllük kontrolü için β-N-Acetylglucosaminidase boyunca nucleocytosolic glikoproteinler (tek bir O-GlcNAc ile değiştirilmiş olan) basit jel algılama, monoklonal antikor kullanımı ile mümkündür, bu tekniğin açıklaması ötesinde Bu makale kapsamında, ama glycosidases hücrelerinde mevcut diğer birçok glikoproteinler ve glycoconjugates çalışma için yararlı araçlar olarak belirtilmelidir. ^12:: NCBI Kitaplık (20.301.239 [NBK1908 Kitaplık ID) ücretsiz çevrimiçi; glikozilasyon bilinen tüm formları kapsamlı bir tedavi "Glikobiyoloji Essentials" ikinci baskısında bulunabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
İnsan koryonik gonadotropin β	Sigma Aldrich	C6572
PCR Tüpleri	VWR	20170-004
PCR PCR	Applied Biosystems	4359659
PNGase F	New England Biolabs	Den P0704'e	Tamponlar ile sağlanır
Protein Deglycosylation Mix	New England Biolabs	P6039	Tamponlar ile sağlanır
α-N-Acetylglalactosaminidase	New England Biolabs	P0734	Tamponu ile sağlanır
α1-2 Fucosidase	New England Biolabs	P0724	Tamponu ile sağlanır
α1-3, 6 galaktosidaz	New England Biolabs	P0731	Tamponu ile sağlanır
β1-3 galaktosidaz	New England Biolabs	P0726	Tamponu ile sağlanır
G7 10X Buffer (500 mM Sodyum Fosfat)	New England Biolabs	---	PNGaseF veya Degl Mix ile birlikte verilir
10X Glikoprotein denatüre Tampon (% 5 SDS, 400 mM DTT)	New England Biolabs	---	PNGaseF veya Degl Mix ile birlikte verilir
% 10 NP-40	New England Biolabs	---	PNGaseF veya Degl Mix ile birlikte verilir
3X SDS yükleme tamponu (187.5 mM Tris-HCl, pH 6.8,% 6 SDS,% 30 gliserol,% 0.03 yabanibademophenol mavi)	New England Biolabs	B7703	1,25 DTT ile birlikte verilir
ColorPlus Protein Marker Prestained	New England Biolabs	P7709
% 10-20 Tris-Glisin Multigel	Cosmo Bio Co	DCB-414.893
Kaset Elektroforez Ünitesi	Cosmo Bio Co	DCB-303.111
Elektroforez Güç Kaynağı EPS 301	GE Healthcare	18-1130-01
Pro-Q Emerald 300 Glikoprotein Stain Kit	Invitrogen	P-21857
Brillant Blue R	Sigma Aldrich	B0149
AlphaImager HP Sistemi	Hücre Biosciences	92-13823-00