依赖的PDZ-CFTR的大分子信号复合物的体外分析

摘要

囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR），上皮细胞的氯离子通道，已与多种蛋白质相互作用和调节重要的细胞过程的CFTR序序介导的相互作用，其中已经有据可查。这个协议描述我们开发组装的PDZ-依赖的CFTR大分子信号复合物的方法在体外。

摘要

囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR），主要位于上皮细胞的顶膜的氯离子通道，起着至关重要的作用，在跨上流体稳态^1-3。 CFTR基因有牵连的两个主要疾病：囊性纤维化^（CF）4和^第5分泌性腹泻。在CF的CFTR氯离子通道的功能活动，合成或降低。这种疾病会影响美国的约1 ⁶ 2500白种人。过度CFTR的活动也被牵连毒素诱导的分泌性腹泻（如霍乱毒素和热稳定大肠杆菌肠毒素）刺激cAMP或cGMP生产在肠道内的⁷例。

越来越多的证据表明CFTR和其他蛋白质的数目越来越多，包括运输，离子通道，受体，激酶，磷酸酶，信号之间的物理和功能相互作用的存在ING分子和细胞骨架的元素，CFTR和其结合蛋白之间相互作用已被证明要严格调节在体外和体内^8-19 CFTR介导的跨膜离子转运。在这个协议中，我们只注重方法，援助在CFTR的羧基末端，它拥有一个蛋白质结合基序之间的相互作用的研究[简称为PSD95/Dlg1/ZO-1（序）序]，和PDZ结构域所指的脚手架蛋白，其中包含一个特定的绑定模块组。到目前为止，几个不同的PDZ骨架蛋白已绑定到CFTR的羧基末端与各种亲缘关系，如NHERF1，NHERF2，PDZK1，PDZK2，CAL（CFTR的相关配体），Shank2，把握^20-27。内CFTR的PDZ结构图案是公认的PDZ骨架蛋白是在过去四年在C端（即1477-DTRL-1480在人类的^CFTR）20个氨基酸。有趣的是，CFTR的，可以绑定多个PDZ结构域都NHERFs和PDZK1，尽管有不同的亲和力^22。这方面的CFTR的具有约束力的多价已被证明是功能性的意义，这表明，PDZ结构骨架蛋白可能促进CFTR的形成大分子信号为特定/选择性和高效率的信号复合物在细胞^16-18。

已开发多个生化分析研究，CFTR涉及蛋白质的相互作用，如免疫共沉淀，下拉法，成对结合法，比色法成对结合实验，和复杂的大分子组装检测^16-19,28,29 。在这里，我们重点对1的PDZ基序依赖CFTR含大分子体外 ，这是我们的实验室研究蛋白质或域的域的相互作用，涉及的CFTR ^16-19,28,29广泛用于复杂装配的详细程序。

研究方案

1。标记细菌中的重组融合蛋白表达和纯化

1. 放大定义CFTR的一览表_2，MRP2的_{，MRP4，β2}受体，和NHERFs（全长或PDZ1过或PDZ2域地区的C-尾（最后50-100个氨基酸，包含在C-末端的PDZ结构图案） ）通过PCR方法。
2. PCR产物克隆到pGEX4T-1载体（如GST-NHERFs的，GST-MRP4 CT），GST融合蛋白的MBP融合蛋白的质粒pMAL-C2载体（如的_MBP-β2受体的CT，MBP-CFTR的CT ），pET30-S融合蛋白（如他 - S-CFTR的CT，他的S-PDZK1）。
3. 变换在蛋白酶缺陷E.大肠杆菌菌株（大肠杆菌BL21-DE3），以减少可能出现的重组蛋白的降解。
4. 在37℃培养过夜增长在卢里亚Bertani培养基含有适当的抗生素（如氨苄青霉素或卡那霉素）（pH值7.0）。在1:10稀释过夜培养，另2小时增长在37°C。在杜奇与0.5-1米M为接下来的4小时在30℃经IPTG在8000离心沉淀细胞×G为10分钟，在4°C。
5. 蔗糖缓冲液裂解细胞（含50 M M的Tris-HCl，pH值8.0，1 M M 1 M M的EDTA，PMSF，10％的蔗糖）溶菌酶（1毫克/毫升），0.2％的Triton X-100和蛋白酶抑制剂。从1升文化起源的细胞沉淀用20毫升。
6. 在4°C，在30分钟摇床混合
7. 自旋为30分钟，在4°C，在20000×G收集上清。
8. 到上层清液，加入1毫升以下的树脂/琼脂糖珠（50％蔗糖缓冲泥浆）：
   • GST融合蛋白谷胱甘肽琼脂糖珠。
   • 爪珠-S的融合蛋白。
   • MBP融合蛋白的直链淀粉树脂。
9. 组合为4小时，在4°Ç在摇床。
10. 洗珠重新悬浮在1X PBS（15毫升），混合2公里N，纺纱800×2分钟，弃去上清Ğ。六次重复此步骤。
11. 从珠，通过各自的洗脱缓冲液（2毫升，每1毫升珠洗脱缓冲液）洗脱蛋白质。
    • GST融合蛋白的洗脱缓冲：25 M M的Tris-HCl（pH值8.0），140 M M氯化钠和20 M M谷胱甘肽。
    • 他的融合蛋白的洗脱缓冲液：20 M M的Tris-HCl（pH值8.0）M氯化钠，500米和200米M咪唑。
    • MBP融合蛋白的洗脱缓冲液：20 M M的Tris-HCl（pH值8.0），200米M氯化钠，1 M M M M的EDTA，1数码地面电视，和10 M M麦芽糖。
12. 透析1X PBS对2大号洗脱蛋白质在4°C间（以避免可能的蛋白质降解）。改变PBS每4小时的四倍。蛋白作为小等分1 Centricon滤波器（截止10,000兆瓦，Millipore公司）和存储集中在-80°C。
13. DET貂皮Bradford法蛋白浓度。评估通过SDS-PAGE使用BSA作为标准蛋白质量。如果蛋白质的完整性是不能令人满意的，如二次净化凝胶过滤或离子交换程序可以使用。 （例如，我们用一个G-75琼脂糖凝胶柱进一步纯化GST融合蛋白）。

2。细胞培养和细胞裂解液的制备

1. 文化幼仓鼠肾细胞（BHK），稳定过表达的CFTR WT和的CFTR _his10或BHK细胞，瞬时过表达旗一览表_2-WT或旗一览表_{2ΔSTL，Madin} 4197犬肾（MDCK细胞细胞），稳定过表达MRP2的鹰的最低限度的基本培养基（MEM）的5％CO ₂含10％小牛血清，青霉素/链霉素聚苯乙烯瓶在37°C间。
2. 文化人类胚胎肾293细胞（HEK293细胞），稳定过表达的CFTR WT的CFTR _his10的在杜尔贝科“的改良Eagle培养基（DMEM培养基）在37°C 5％的CO ₂与10％小牛血清和青霉素/链霉素聚苯乙烯瓶补充。
3. 裂解细胞裂解液（PBS - 0.2％TRITON-X-100的补充含有M M phenylmethylsulphonyl氟化物，1微克/毫升抑肽酶，1微克/毫升亮肽素，1微克/毫升胃蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂的混合物）;使用500μL裂解液，每60毫米培养皿，1000μL裂解液，每100毫米的培养皿。
4. 20分钟摇滚细胞裂解液在4°C，并删除15分钟在16000×g下离心的不溶性物质，在4°C。确定由Bradford法蛋白浓度。

（3） 在体外一个CFTR含的高分子复合体大会（CFTR的PDZK1-MRP4）

1. 到200μL裂解缓冲液（PBS - 0.2％的Triton-X的100蛋白酶抑制剂），添加20μg纯化GST-MRP4-C终端50 AA（CT50）融合蛋白。
2. 加入S-PDZK1融合蛋白纯化的各种款项（0-40微克）。
3. 上旋转22°1-2 C H搅拌机混合的两种蛋白质。
4. 加入20微升谷胱甘肽珠（50％浆料）的蛋白质混合物，继续拌匀，另1小时。这一步也被称为成对结合。
5. 在此期间，准备HEK293细胞裂解过度旗，CFTR（WT）如上所述，在第2步）。
6. 裂解液洗两次复杂。旋转800×G为每洗1分钟，小心吸出上清后，每洗。谨慎使用不吸在底部的珠子。
7. 添加上述准备HEK293细胞裂解珠，轻轻混合为3小时（或隔夜）在4°C。
8. 洗珠广泛裂解液三个步骤3.6）倍。
9. 洗脱的蛋白质使用30μL的样品缓冲液（5×）：0.6米的Tris-HCl（pH值6.8），50％的甘油，2％的SDS，0.1％溴酚蓝;含5％β-巯基乙醇。
10. 孵育在37°C间水浴10-15分钟，和自旋为5000×30秒Ğ沉淀珠。
11. 加载到4-15％凝胶洗脱液。
12. 运行约30-40分钟的SDS-PAGE。
13. 蛋白条带转移到PVDF膜，为1.5小时。
14. 座中的TBS-吐温膜含有5％非脂乳。
15. 酝酿的初级抗体（如抗CFTR的抗体，R1104）膜在4°C间，过夜。
16. 膜用TBS-吐温洗5分钟，六次。
17. 在22°C孵育45分钟二次抗体（如羊抗鼠HRP标记的^第二抗体）膜
18. 膜用TBS-吐温洗5分钟，六次。
19. 通过的ECL蛋白带可视化。
20. 代表性的数据， 如图1所示。

jove_title“> 4代表结果。

如图1所示的CFTR含大分子信号在体外组装的复杂的例子。 MRP4的C-末端50个氨基酸（MRP4-CT50），，PDZK1，全长度的CFTR（ 图1， 底部 ）之间形成一个大分子复合物。形成复合物剂量依赖性增加，越来越多的中介蛋白质，PDZK1（ 图1， 底部 ^）18。

图1图示（ 顶部 ）的大分子复杂的检测。大分子复合物在体外检测与三种蛋白质在剂量依赖性（ 底部 ^{）18（GST-MRP4-CT50，}他- S-PDZK1，旗CFTRwt）。

	的CFTR的NHERF1-β2 AR（见14）	CFTR的NHERF2-LPA的2（注释15）	CFTR的PDZ蛋白MRP的2（注释17）	CFTR的PDZK1-MRP4（注释16）
亲和力珠	直链淀粉树脂	S - 蛋白琼脂糖	直链淀粉树脂	谷胱甘肽琼脂糖
纯化的蛋白质-1	MBP的β-2受体的CT	- S-CFTR的CT	MBP-CFTR的CT	GST-MRP4 CT
纯化的蛋白质-2	GST-NHERF1	GST-NHERF2的	的GST-PDZ蛋白	- S-PDZK1
纯化蛋白3（或细胞裂解）	CFTR基因-WT的CFTR his10的的 （染BHK的HEK细胞裂解）	旗-LPA的2-WT或旗一览表2ΔSTL（染BHK细胞裂解物）	MRP2的（MDCK细胞裂解）	纯化旗的CFTR WT或的CFTR his10（或细胞裂解物）
抗体	抗-CFTR的IgG	反旗酶的	抗-MRP2的IgG	反旗酶的

表1总结各种CFTR的含大分子复合物在体外组装。

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讨论

在这个协议中，我们展示了一个方法， 在体外装配，检测包含使用纯化蛋白（或蛋白质碎片）和/或细胞裂解大分子信号复合物的CFTR报告以前^{16-19,29,30。}为了达到最佳效果临界点以下，在筹备过程中，需要特别注意：

• 重要的是，洗脱缓冲液的pH值调整到8.0后加入还原型谷胱甘肽的纯化GST融合蛋白，如步骤1）中所述时。此外还原型谷胱甘肽后，pH值可低到3.0。如果PH值未调整?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
pGEX4T-1载体	GE医疗集团	28-9545-49	原Amersham Biosciences公司
质粒pMAL-C2载体	New England Biolabs公司
pET30载体	电解二氧化锰化学品	69077-3	前Novagen公司
谷胱甘肽琼脂糖珠	BD公司	554780
直链淀粉树脂	New England Biolabs公司	E8021S
爪珠	Clontech公司	635501
还原型谷胱甘肽	BD公司	554782
咪唑	费舍尔	BP305-50
麦芽糖	费舍尔	BP684-500
S - 蛋白琼脂糖	电解二氧化锰化学品	69704-3	前Novagen公司
反旗酶的	西格玛	A8592
抗-CFTR的IgG	定制	R1104	单克隆抗体识别抗原的CFTR AA 722-734
抗-MRP2的IgG	Chemicon公司国际	MAB4148	现在部分的微孔