Análise in vitro de PDZ-dependentes Complexos Macromoleculares CFTR Sinalização

Resumo

A fibrose cística regulador da condutância transmembranar (CFTR), um canal de cloreto epitelial, tem sido relatado para interagir com várias proteínas e regulam importantes processos celulares, entre eles os CFTR PDZ motivo mediadas-interacções têm sido bem documentados. Este protocolo descreve métodos desenvolvidos para montar um macromolecular CFTR PDZ-dependente sinalização complexo In vitro.

Resumo

A fibrose cística reguladora da condutância transmembrana (CFTR), um canal de cloreto localizados principalmente nas membranas apicais das células epiteliais, desempenha um papel crucial na homeostasia de fluidos transepitelial ^1-3. CFTR tem sido implicado em duas doenças principais: fibrose cística ⁴ (CF) e secretora diarreia ^5. Na FC, a síntese ou a actividade funcional do CFTR Cl-canal é reduzida. Esta doença afecta cerca de 1 em 2500 caucasianos nos Estados Unidos ^6. Actividade CFTR excessiva também tem sido implicado em casos de toxina induzida por diarreia secretória (por exemplo, por toxina da cólera e enterotoxina calor coli estável E.) que estimula a produção de cAMP ou cGMP no intestino ^7.

Evidências sugerem a existência de interações físicas e funcionais entre CFTR e um número crescente de outras proteínas, incluindo os transportadores, canais iônicos, receptores, quinases, fosfatases, sinalmoléculas ing, e os elementos do citoesqueleto, e estas interacções entre CFTR e as suas proteínas de ligação têm sido mostrados para ser criticamente envolvidos na regulação mediada por CFTR transporte de iões transepitelial in vitro e também in vivo ^8-19. Neste protocolo, vamos nos concentrar apenas sobre os métodos que auxiliam no estudo das interações entre CFTR cauda carboxilo terminal, que possui um motivo de ligação às proteínas [referido como PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motivo], e um grupo de andaime proteínas, que contêm um módulo de ligação específica referida como domínios PDZ. Até agora, várias proteínas diferentes PDZ andaime têm sido relatados para se ligar ao terminal carboxilo da cauda de CFTR, com afinidades diferentes, tais como NHERF1 e NHERF2 e PDZK1 e PDZK2, CAL (CFTR-associated ligando), Shank2, e agarrar ^20-27. O motivo PDZ dentro CFTR que é reconhecido pelo PDZ andaime proteínas são os últimos quatro aminoácidos no terminal C (ie, 1477-DTRL-1480 em CFTR humano) ^20. Curiosamente,CFTR pode ligar mais do que um domínio PDZ de ambos os NHERFs e PDZK1, embora com diferentes afinidades ^22. Este multivalência com respeito à ligação CFTR foi mostrado para ser de importância funcional, sugerindo que as proteínas PDZ andaime pode facilitar a formação de complexos macromoleculares CFTR sinalização para a sinalização específicas / selectiva e eficaz em células ^16-18.

Vários ensaios bioquímicos têm sido desenvolvidos para estudar CFTR-envolvendo interacções proteína, tais como co-imunoprecipitação, suspenso ensaio, pares ensaio de ligação, por pares de ensaio colorimétrico de ligação, e doseamento macromolecular montagem complexa ^16-19,28,29 . Aqui vamos nos concentrar sobre os procedimentos detalhados de montagem de um PDZ motivo dependente da CFTR macromolecular contendo complexo in vitro, que é usado amplamente por nosso laboratório para estudar proteína-proteína ou domínio domínio interações envolvendo CFTR ^16-19,28,29.

Protocolo

1. Expressão e Purificação de Proteínas de Fusão recombinantes Tagged em bactérias

1. Amplificar regiões definidas do C-caudas (os últimos 50-100 aminoácidos contendo os motivos PDZ em C-terminal) para CFTR, LPA _2, MRP2, MRP4, β ₂ AR, e NHERFs (comprimento completo ou PDZ1 ou PDZ2 domínios ) por metodologia de PCR.
2. Clonar os produtos de PCR em pGEX4T-1 vector para GST-proteínas de fusão (tal como GST-NHERFs, GST-MRP4 CT), pMAL-C2 vector para MBP de fusão de proteínas (tais como MBP-β ₂ AR CT, MBP-CFTR CT ), e pET30 para His-S-proteínas de fusão (como o seu-S-CFTR CT, His-S-PDZK1).
3. Transformar num E. protease deficiente coli estirpe (BL21-DE3) para minimizar a degradação da proteína recombinante possível.
4. Crescer a cultura durante a noite a 37 ° C em meio Luria-Bertani meio (pH 7,0) contendo antibióticos apropriados (tais como a ampicilina ou canamicina). Dilui-se a cultura durante a noite a 1:10 e crescer durante mais 2 h, a 37 ° C. Emduzir com 0,5-1 m M IPTG para a próxima 4 horas a 30 ° C. Sedimentar as células por centrifugação a 8000 × g durante 10 min a 4 ° C.
5. Lisar as células em tampão de sacarose (50 m M de Tris-HCl, pH 8,0, 1 m M de EDTA, 1 m M de PMSF, e 10% de sacarose) contendo lisozima (1 mg / mL), Triton 0,2% X-100, e protease inibidores. Use 20 mL de sedimento de células proveniente de 1 L de cultura.
6. Misturar num agitador rotativo durante 30 min a 4 ° C.
7. Girar a 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Recolher o sobrenadante claro.
8. Para o sobrenadante claro, adicionar 1 mL de resina nas seguintes / agarose (suspensão de 50% em tampão de sacarose):
   • Pérolas de glutationa agarose para proteínas de fusão GST.
   • Contas Talon para His-S proteínas de fusão.
   • Amilose resina para proteínas de fusão MBP.
9. Mistura-se durante 4 horas a 4 ° C em um agitador rotativo.
10. Lavar os grânulos por ressuspensão em PBS 1x (15 mL), misturando durante 2 min, girando a 800 × g durante 2 min, e descartar o sobrenadante. Repita este passo para seis vezes.
11. Eluir a proteína a partir das pérolas usando tampão de eluição respectivo (2 mL de tampão de eluição por 1 ml de esferas).
    • Tampão de eluição para as proteínas de fusão GST: 25 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 140 m M de NaCl, e 20 m M glutationa reduzida.
    • Tampão de eluição de proteínas sua fusão: 20 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 500 m M de NaCl, e 200 m M imidazol.
    • Tampão de eluição para proteínas de fusão MBP: 20 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 200 m M de NaCl, 1 m M de EDTA, 1 m M de DTT, e 10 m M maltose.
12. Dialisar as proteínas eluídas contra 2 L de 1x PBS a 4 ° C (para evitar a degradação da proteína possível). Alterar PBS a cada 4 horas, durante quatro vezes. Concentra-se a proteína utilizando um filtro de Centricon (10.000 cutoff MW, Millipore) e armazenada como pequenas alíquotas a -80 ° C.
13. Detarminho concentração da proteína pelo método de Bradford. Avaliar a qualidade de proteína por SDS-PAGE utilizando BSA como padrão. Se a integridade da proteína não for satisfatório, os processos de purificação secundários, tais como filtração em gel ou de permuta iónica podem ser utilizados. (Por exemplo, utilizou-se um G-75 coluna de Sepharose para purificar ainda mais GST-proteína de fusão).

2. Cultura de Células e Preparação lisado celular

1. Cultura rim de hamster bebé (BHK) que de forma estável sobre-expresso CFTR-wt e _CFTR-his10 ou células BHK que transitoriamente sobre-express-Flag LPA _2-peso ou Bandeira-LPA _2-ΔSTL e Madin-Darby rim canino (MDCK ) as células que expressam de forma estável sobre-MRP2 em meio essencial mínimo de Eagle (MEM) contendo 10% de soro fetal de vitelo e penicilina / estreptomicina em frascos de poliestireno a 37 ° C com 5% de CO _2.
2. Cultura de rim embrionário humano 293 (HEK293) células que de forma estável sobre-expresso CFTR-wt e _CFTR-his10 em Dulbecco'Média s modificado de Eagle (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e penicilina / estreptomicina, em frascos de poliestireno a 37 ° C com 5% de CO _2.
3. Lisar as células em tampão de lise (PBS - 0,2% de Triton-X-100 suplementado com uma mistura de inibidores de protease contendo 1 M de fluoreto de fenilmetilsulfonil m, 1 ug / ml de aprotinina, 1 ug / mL de leupeptina, 1 ug / mL de pepstatina); utilização 500 uL de tampão de lise para cada placa de Petri de 60 mm, e 1000 uL de tampão de lise para cada placa de Petri de 100 mm.
4. Balançar a célula lisados ​​durante 20 min a 4 ° C, e remover o material insolúvel por centrifugação a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Determinar a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford.

3. Em Assembléia Vitro de um complexo macromolecular contendo CFTR (CFTR-PDZK1-MRP4)

1. Em 200 uL de tampão de lise (PBS - 0,2% de Triton-X 100 + inibidores da protease), adicionar 20 ug de GST-purificada MRP4-C-terminal50 aa (CT50) proteína de fusão.
2. Adicionar várias quantidades (0-40 ug) de Purificou His-S-PDZK1 proteína de fusão.
3. Misturar as duas proteínas num misturador rotativo a 22 ° C durante 1-2 h.
4. Adicionar 20 pérolas de glutationa microlitro (50% de lama) na mistura de proteínas, e continuar a misturar por mais 1 h. Este passo é também referido como pares de ligação.
5. Durante este tempo, preparar os lisados ​​de células HEK293 que superexpressam a bandeira-CFTR (em peso) como acima descrito no Passo 2).
6. Lavar o complexo duas vezes com tampão de lise. Girar a 800 × g durante 1 min para cada lavagem e aspirar cuidadosamente o sobrenadante após cada lavagem. Tenha cuidado para não sugar as contas no fundo.
7. Adicionar os preparados acima HEK293 lisados ​​de células para os grânulos, e misturar suavemente a 4 ° C durante 3 h (ou durante a noite).
8. Lavar os grânulos extensivamente três vezes com tampão de lise, conforme descrito no Passo 3,6).
9. Eluir as proteínas utilizando 30 uL Tampão de amostra (5 ×): 0,6 M Tris-HCl (pH 6,8), glicerol a 50%, SDS a 2%, e 0,1% de azul de bromofenol; contendo 5% de β-mercaptoetanol.
10. Incubar a 37 ° C banho de água durante 10-15 min, e giram a 5000 × g durante 30 s para precipitar os grânulos.
11. Carregar todo o eluído em gel de 4-15%.
12. Executar SDS-PAGE para cerca de 30-40 min.
13. Transferir bandas de proteína para a membrana PVDF, durante 1,5 horas.
14. Bloquear a membrana em TBS-Tween contendo gordura do leite a 5% não.
15. Incubar a membrana com o anticorpo primário (tais como anti-CFTR IgG, R1104) a 4 ° C, durante a noite.
16. Lava-se a membrana com TBS-Tween durante 5 min, seis vezes.
17. Incubar a membrana com anticorpo secundário (tal como o anticorpo de cabra anti-rato conjugado com HRP ^nd 2) durante 45 min a 22 ° C.
18. Lava-se a membrana com TBS-Tween durante 5 min, seis vezes.
19. Visualizar as bandas de proteínas através de ECL.
20. Os dados representativos são mostrados na Figura 1.

jove_title "> 4. resultados representativos

Um exemplo de CFTR contendo complexo macromolecular de sinalização que foi montado in vitro é mostrado na Figura 1. Um complexo macromolecular foi formado entre MRP4 C-terminal 50 aminoácidos (MRP4-CT50) e PDZK1, e de comprimento completo CFTR (Figura 1, parte inferior). A formação do complexo aumentou dose-dependente com quantidades crescentes de proteína do intermediário, PDZK1 (Figura 1, parte inferior) ^18.

Figura 1. Uma representação pictórica do ensaio complexo macromolecular (topo). Um complexo macromolecular foi detectada in vitro com três proteínas (GST-MRP4-CT50, His-S-PDZK1, e-Flag CFTRwt) de uma forma dependente da dose (inferior) ^18.

	CFTR-NHERF1-β 2 AR (ref. 14)	CFTR-NHERF2-LPA 2 (ref. 15)	CFTR-PDZ proteínas-MRP 2 (ref. 17)	CFTR-PDZK1-MRP4 (ref. 16)
Contas de afinidade	Resina de amilose	S-proteína de agarose	Resina de amilose	Glutationa agarose
Purificou-proteína-1	MBP β-2 AR CT	His-S-CFTR CT	MBP-CFTR CT	GST-MRP4 CT
Purificou-2 de proteína	GST-NHERF1	GST-NHERF2	GST-PDZ proteínas	His-S-PDZK1
Proteína purificada-3 (ou lisados ​​de células)	CFTR-wt ou CFTR-his10 (BHK ou lisados ​​de células HEK)	BandeiraLPA-2-em peso ou bandeira-LPA 2-ΔSTL (lisados ​​de células BHK)	MRP2 (lisados ​​de células MDCK)	Purificou-Flag CFTR-wt ou CFTR-his10 (ou lisados ​​de células)
Anticorpo	Anti-IgG CFTR	Anti-Flag HRP	Anti-IgG MRP2	Anti-Flag HRP

Resumo Tabela 1. De vários complexos de CFTR contendo macromoleculares montadas in vitro.

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Discussão

Neste protocolo que demonstraram um método para a montagem in vitro e detecção de um complexo macromolecular CFTR contendo sinalização utilizando proteínas purificadas (ou fragmentos de proteínas) e / ou lisados ​​celulares como relatado anteriormente ^16-19,29,30. Para alcançar melhores resultados os seguintes pontos críticos durante o processo de preparação requerem especial atenção:

• É importante que o pH do tampão de eluição ser ajustado para 8,0 após a adição d...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de Catálogo	Comentários
pGEX4T-1 vector	GE Healthcare	28-9545-49	anteriormente Amersham Biosciences
pMAL-C2 vector	New England Biolabs
pET30 vector	Merck Química	69077-3	anteriormente Novagen
Esferas de agarose de glutationa	BD Biosciences	554780
Resina de amilose	New England Biolabs	E8021S
Contas Talon	Clontech	635501
glutationa reduzida	BD Biosciences	554782
imidazol	Pescador	BP305-50
maltose	Pescador	BP684-500
S-proteína de agarose	Merck Química	69704-3	anteriormente Novagen
Anti-Flag HRP	Sigma	A8592
Anti-IgG CFTR	Feito sob encomenda	R1104	mAb reconhecendo CFTR epítopo em aa 722-734
Anti-IgG MRP2	Chemicon International	MAB4148	Agora uma parte da Millipore