L'analisi in vitro dei complessi CFTR PDZ-dipendenti macromolecolari di segnalazione

Riepilogo

Transmembrana della fibrosi cistica regolatore conduttanza (CFTR), un canale cloruro epiteliale, è stata riportata per interagire con varie proteine ​​e regolano importanti processi cellulari, tra i quali i CFTR PDZ motivo mediate da interazioni sono stati ben documentati. Questo protocollo descrive i metodi che abbiamo sviluppato per assemblare un PDZ-dipendente macromolecolare CFTR segnalazione complessa In vitro.

Abstract

Transmembrana della fibrosi cistica regolatore della conduttanza (CFTR), un canale del cloro si trova soprattutto a livello delle membrane apicali delle cellule epiteliali, gioca un ruolo cruciale nella omeostasi del liquido transepiteliale ^1-3. CFTR è stata implicata in due importanti malattie: fibrosi cistica (CF) ⁴ e ⁵ secretoria diarrea. In CF, la sintesi o attività funzionale della CFTR Cl-canale è ridotta. Questo disturbo colpisce circa 1 su 2500 caucasici negli Stati Uniti ^6. Attività eccessiva CFTR è stata anche implicata in casi di tossina indotta diarrea secretoria (ad esempio, da tossina del colera e stabile al calore enterotossina E. coli) che stimola la produzione di cAMP o cGMP nell'intestino ^7.

Accumulare le prove suggeriscono l'esistenza di interazioni fisiche e funzionali tra CFTR e un numero crescente di altre proteine, tra trasportatori, canali ionici, recettori, chinasi, fosfatasi, segnalemolecole zione ed elementi del citoscheletro, e queste interazioni tra CFTR e le sue proteine ​​leganti hanno dimostrato di essere criticamente coinvolte nella regolazione CFTR trasporto mediato transepiteliale ionico in vitro e in vivo ^8-19. In questo protocollo, ci concentriamo solo sui metodi che gli aiuti nello studio delle interazioni tra CFTR carbossile terminale della coda, che possiede una proteina di legame motivo [denominato PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motivo], e un gruppo di proteine ​​scaffold, che contengono un modulo di legame specifico denominato domini PDZ. Finora, molte diverse proteine ​​PDZ ponteggi sono stati riportati da associare alla coda terminale carbossile di CFTR con affinità diverse, ad esempio, i NHERF1 NHERF2 e PDZK1 e PDZK2 e CAL (CFTR-associata ligando), Shank2, e GRASP ^20-27. Il motivo PDZ all'interno CFTR che è riconosciuto da PDZ proteine ​​scaffold è ultimi quattro amminoacidi al C terminale (cioè, 1477-DTRL-1480 in umano CFTR) ^20. Interessante,CFTR può legare più di un dominio PDZ sia NHERFs e PDZK1, pur in diversi affinità ^22. Questa polivalenza rispetto CFTR legame ha dimostrato di essere di importanza funzionale, suggerendo che le proteine ​​PDZ impalcatura può facilitare la formazione di complessi macromolecolari CFTR segnalazione per la segnalazione specifici / selettivo ed efficace in cellule ^16-18.

Più saggi biochimici sono stati sviluppati per studiare CFTR, che coinvolge interazioni proteiche, come la co-immunoprecipitazione, pull-down assay, pair-wise saggio di legame, colorimetrico pair-wise saggio di legame, e il dosaggio di assemblaggio macromolecolare complessa ^16-19,28,29 . Qui ci concentriamo sulle procedure dettagliate di assemblaggio di un motivo PDZ CFTR-dipendente contenenti macromolecole complesse in vitro, che è ampiamente utilizzato dal nostro laboratorio per studiare proteina-proteina o di dominio nel dominio delle interazioni che coinvolgono CFTR ^16-19,28,29.

Protocollo

1. Espressione e purificazione di proteine ​​ricombinanti in batteri Fusion etichettate

1. Amplifica le regioni definite del C-code (gli ultimi 50-100 aminoacidi contenenti i motivi PDZ a C-terminale) per CFTR, LPA _2, MRP2, MRP4, β ₂ AR, e NHERFs (full-length o PDZ1 o PDZ2 domini ) con approccio PCR.
2. Clonare i prodotti di PCR in pGEX4T-1 vettore per le proteine ​​di fusione GST-(come GST-NHERFs, GST-MRP4 CT), pMAL-C2 vettore per MBP-fusione proteine ​​(come MBP-β ₂ AR CT, MBP-CFTR CT ), e per i Suoi pET30-S-proteine ​​di fusione (come la sua-S-CFTR CT, His-S-PDZK1).
3. Trasforma in una proteasi carente di E. coli ceppo (BL21-DE3) per ridurre al minimo possibile degradazione della proteina ricombinante.
4. Crescere la coltura di una notte a 37 ° C in terreno Luria-Bertani (pH 7,0) contenente antibiotici adatti (come ampicillina o kanamicina). Diluire la coltura di una notte a 1:10 e crescere per altre 2 ore a 37 ° C. Indurre con 0,5-1 m M IPTG per i prossimi 4 ore a 30 ° C. Pellet delle cellule per centrifugazione a 8000 g per 10 min a 4 ° C.
5. Lisare le cellule in tampone saccarosio (50 m M Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, e 10% di saccarosio) contenente lisozima (1 mg / mL), 0,2% Triton X-100, e proteasi inibitori. Usare 20 mL per pellet di cellule proveniente da 1 L della cultura.
6. Mescolare su un agitatore rotante per 30 minuti a 4 ° C.
7. Spin a 20.000 xg per 30 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante chiaro.
8. Nel supernatante chiaro, aggiungere 1 ml delle seguenti resina / agarosio perline (50% slurry in tampone saccarosio):
   • Glutatione perline di agarosio per proteine ​​di fusione GST.
   • Perle Talon per le Sue S-proteine ​​di fusione.
   • Resina amilosio per proteine ​​di fusione MBP.
9. Mescolare per 4 ore a 4 ° C su un agitatore rotante.
10. Lavare le perle risospendendo in 1x PBS (15 ml), mescolare per 2 min, filatura a 800 g per 2 min, e scartando il supernatante. Ripetere questo passaggio per sei volte.
11. Eluire la proteina dalle perline mediante rispettivo buffer di eluizione (2 mL di tampone di eluizione per 1 mL di perline).
    • Tampone di eluizione per proteine ​​di fusione GST: 25 m M Tris-HCl (pH 8,0), 140 m M NaCl, e 20 m M glutatione ridotto.
    • Tampone di eluizione per le sue proteine ​​di fusione: 20 m M Tris-HCl (pH 8,0), 500 m M NaCl, e 200 mM imidazolo.
    • Tampone di eluizione per proteine ​​di fusione MBP: 20 m M Tris-HCl (pH 8,0), 200 m M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, e 10 mM maltosio.
12. Dializzare le proteine ​​eluite contro 2 L di 1x PBS a 4 ° C (per evitare la possibile degradazione delle proteine). Sostituire ogni 4 ore per quattro volte PBS. Concentrare la proteina utilizzando un filtro Centricon (10.000 taglio MW, Millipore), e memorizza come piccole aliquote a -80 ° C.
13. Determellino la concentrazione di proteina mediante il metodo Bradford. Valutare qualità delle proteine ​​mediante SDS-PAGE usando BSA come standard. Se l'integrità della proteina non è soddisfacente, le procedure di purificazione secondarie, come la filtrazione su gel o scambio ionico possono essere utilizzati. (Ad esempio, abbiamo utilizzato una colonna G-75 Sepharose per purificare ulteriormente-proteina di fusione GST).

2. Di coltura cellulare e Preparazione del lisato cellulare

1. Bambino Cultura renali di criceto (BHK) stabilmente cellule che over-esprimono CFTR-peso e _CFTR-his10 o cellule BHK transitoriamente che over-esprimono Flag-LPA _2-peso o Flag-LPA _2-ΔSTL e Madin-Darby rene canino (MDCK stabilmente) cellule che sovra-esprimono MRP2 in mezzo minimo essenziale di Eagle (MEM) contenente 10% siero di vitello fetale e penicillina / streptomicina in fiasche di polistirene a 37 ° C con 5% CO _2.
2. Cultura embrionali umane di rene (293 HEK293) stabilmente cellule che over-esprimono CFTR-peso e _CFTR-his10 in Dulbecco'S mezzo Eagle modificato (DMEM) integrato con 10% siero fetale bovino e penicillina / streptomicina in fiasche di polistirene a 37 ° C con 5% CO _2.
3. Lisare le cellule in tampone di lisi (PBS - 0,2% Triton-X-100 integrato con una miscela di inibitori di proteasi contenenti 1 mM fenilmetilsolfonilfluoruro, 1 ug / ml di aprotinina, 1 ug / mL di leupeptina, 1 ug / ml di pepstatina); uso 500 tampone di lisi microlitri per ogni 60 mm piastra di Petri, e 1000 tampone di lisi microlitri per ogni 100 mm piastra di Petri.
4. Rock the lisati cellulari per 20 min a 4 ° C, e rimuovere il materiale insolubile mediante centrifugazione a 16.000 xg per 15 min a 4 ° C. Determinare la concentrazione proteica con il saggio Bradford.

3. In Assemblea in vitro di un CFTR contenente complesso macromolecolare (CFTR-PDZK1-MRP4)

1. In 200 microlitri di tampone di lisi (PBS - 0,2% Triton X-100 + inibitori della proteasi), aggiungere 20 mcg purificato GST-MRP4 C-terminale50 bis (CT50), proteina di fusione.
2. Aggiungi vari importi (0-40 mg) di purificata His-S-PDZK1 proteina di fusione.
3. Mescolare le due proteine ​​su un agitatore rotante a 22 ° C per 1-2 h.
4. Aggiungi 20 perle del glutatione pl (50% slurry) nella miscela di proteine, e continuare a mescolare per un altro 1 h. Questa fase viene anche indicato come a coppie legante.
5. Durante questo tempo, preparare le HEK293 lisati cellulari che iperesprimono Flag-CFTR (wt) come sopra descritto al punto 2).
6. Lavare il complesso due volte con tampone di lisi. Spin a 800 xg per 1 minuto per ogni lavaggio e aspirare accuratamente il supernatante dopo ogni lavaggio. Prestare attenzione a non succhiare le perline in fondo.
7. Aggiungere preparato sopra lisati cellulari HEK293 alle perle, e mescolare delicatamente a 4 ° C per 3 h (o tutta la notte).
8. Lavare le perline estesamente tre volte con tampone di lisi, come descritte nella Fase 3,6).
9. Eluire le proteine ​​con 30 microlitri Sample Buffer (5 ×): 0,6 M Tris-HCl (pH 6,8), 50% glicerolo, 2% SDS, e 0,1% blu di bromofenolo, contenente 5% di β-mercaptoetanolo.
10. Incubare in bagnomaria a 37 ° C per 10-15 min, e far girare a 5000 × g per 30 s per far precipitare le perline.
11. Caricare tutto l'eluato su gel 4-15%.
12. Eseguire SDS-PAGE per circa 30-40 min.
13. Trasferimento bande proteiche alla membrana PVDF, per 1,5 ore.
14. Bloccare la membrana in TBS-Tween contenente 5% di latte non grasso.
15. Incubare la membrana con l'anticorpo primario (ad esempio anti-IgG CFTR, R1104) a 4 ° C, una notte.
16. Lavare la membrana con TBS-Tween per 5 min, sei volte.
17. Incubare la membrana con anticorpo secondario (come capra anti-topo coniugato HRP-anticorpo 2 ^°) per 45 min a 22 ° C.
18. Lavare la membrana con TBS-Tween per 5 min, sei volte.
19. Visualizzare le bande proteiche tramite ECL.
20. I dati rappresentativi sono mostrati in Figura 1.

jove_title "> 4. risultati rappresentativi

Un esempio di CFTR contenente complesso macromolecolare segnalazione che è stata assemblata in vitro è illustrato nella figura 1. Un complesso macromolecolare è formata tra MRP4 C-terminale di 50 amminoacidi (MRP4-CT50), PDZK1 e full-length CFTR (Figura 1, in basso). La formazione del complesso aumento dose-dipendente con quantità crescenti di proteina intermediario, PDZK1 (Figura 1, in basso) ^18.

Figura 1. Una rappresentazione pittorica del saggio complesso macromolecolare (in alto). Un complesso macromolecolare è stato rilevato in vitro con tre proteine ​​(GST-MRP4-CT50, His-S-PDZK1, e Flag-CFTRwt) in un modo dipendente dalla dose (in basso) ^18.

	CFTR-NHERF1-β 2 AR (rif. 14)	CFTR-NHERF2-LPA 2 (rif. 15)	CFTR-PDZ proteine ​​MRP-2 (rif. 17)	CFTR-PDZK1-MRP4 (rif. 16)
Affinity perline	Amilosio resina	S-proteina agarosio	Amilosio resina	Glutatione agarosio
Proteina purificata-1	MBP-β 2 AR CT	His-S-CFTR CT	MBP-CFTR CT	GST-MRP4 CT
Proteina purificata-2	GST-NHERF1	GST-NHERF2	GST-proteine ​​PDZ	His-S-PDZK1
Proteina purificata-3 (o lisati cellulari)	CFTR-peso o CFTR-his10 (BHK o lisati cellulari HEK)	BandieraLPA-2-peso o Flag-LPA 2-ΔSTL (lisati cellulari BHK)	MRP2 (lisati cellulari MDCK)	Purificata Flag-CFTR wt-o-CFTR his10 (o lisati cellulari)
Anticorpo	Anti-IgG CFTR	Anti-Flag HRP	Anti-IgG MRP2	Anti-Flag HRP

Tabella 1. Sintesi di vari CFTR contenenti complessi macromolecolari assemblati in vitro.

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Discussione

In questo protocollo abbiamo dimostrato un metodo in vitro per l'assemblaggio e il rilevamento di una CFTR contenente complesso macromolecolare segnalazione utilizzando proteine ​​purificate (o frammenti di proteine) e / o lisati di cellule come riportato precedentemente ^16-19,29,30. Per ottenere i migliori risultati i seguenti punti critici durante il processo di preparazione richiedono una particolare attenzione:

• È importante che il pH del tampone di eluizione essere regolata ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
pGEX4T-1 vettore	GE Healthcare	28-9545-49	già Amersham Biosciences
pMAL-C2 vettoriale	New England BioLabs
pET30 vettore	EMD Chemicals	69077-3	ex Novagen
Glutatione agarosio perline	BD Biosciences	554780
Amilosio resina	New England BioLabs	E8021S
Talon perline	Clontech	635501
glutatione ridotto	BD Biosciences	554782
imidazolo	Pescatore	BP305-50
maltosio	Pescatore	BP684-500
S-proteina agarosio	EMD Chemicals	69704-3	ex Novagen
Anti-Flag HRP	Sigma	A8592
Anti-IgG CFTR	Su misura	R1104	mAb riconoscendo CFTR epitopo al aa 722-734
Anti-IgG MRP2	Chemicon International	MAB4148	Ora una parte di Millipore