L'analyse in vitro de PDZ-dépendants complexes macromoléculaires CFTR de signalisation

Résumé

Kystique régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose (CFTR), un canal chlorure épithéliale, a été signalé à interagir avec des protéines et de réglementer divers processus cellulaires importants, parmi lesquels les CFTR PDZ motif-médiées par les interactions ont été bien documentés. Ce protocole décrit les méthodes que nous avons développés pour assembler un macromoléculaire CFTR PDZ-dépendante complexe de signalisation In vitro.

Résumé

Kystique régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose (CFTR), un canal chlorure situés principalement au niveau des membranes apicales des cellules épithéliales, joue un rôle crucial dans l'homéostasie du fluide transépithélial ^1-3. CFTR a été impliqué dans deux maladies majeures: la fibrose kystique (CF) ⁴ et la diarrhée sécrétoire ^5. Dans FC, la synthèse ou l'activité fonctionnelle de la protéine CFTR Cl-canal est réduite. Ce trouble affecte environ 1 sur 2500 personnes de race blanche aux États-Unis ^6. Activité de la CFTR excessive a également été impliquée dans des cas de toxine induit une diarrhée sécrétoire (par exemple, par la toxine du choléra et de la chaleur entérotoxine stable de E. coli) qui stimule la production de GMPc AMPc ou dans l'intestin ^7.

Les preuves qui s'accumulent suggèrent l'existence d'interactions physiques et fonctionnelles entre CFTR et un nombre croissant d'autres protéines, y compris les transporteurs, canaux ioniques, récepteurs, les kinases, les phosphatases, de signauxmolécules ING et éléments du cytosquelette, et ces interactions entre la protéine CFTR et de ses protéines de liaison ont été montré à la critique impliquée dans la régulation de CFTR-médiée transport des ions transépithélial in vitro et également in vivo ^8-19. Dans ce protocole, nous nous concentrons uniquement sur les méthodes que l'aide dans l'étude des interactions entre la queue CFTR carboxyle terminal, qui possède un motif liaison aux protéines [dénommé PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], et une un groupe de protéines échafaudage, qui contiennent un module de liaison spécifique dénommé domaines PDZ. Jusqu'à présent, plusieurs différentes protéines d'échafaudage PDZ ont été signalés à se lier à la queue carboxyle terminal de la protéine CFTR avec des affinités différentes, telles que NHERF1, les NHERF2, les PDZK1, les PDZK2, CAL (CFTR associée à un ligand), Shank2, et le GRASP ^20-27. Le motif PDZ dans CFTR qui est reconnu par PDZ protéines d'échafaudage est les quatre derniers acides aminés à l'extrémité C-terminale (c.-à-1477-DTRL-1480 chez l'homme CFTR) ^20. Il est intéressant,CFTR peut se lier plus d'un domaine PDZ des deux NHERFs et PDZK1, quoique avec plus ou moins d'affinités ^22. Cette polyvalence à l'égard de la protéine CFTR contraignant a été démontré que de l'importance fonctionnelle, ce qui suggère que PDZ protéines d'échafaudage peuvent faciliter la formation de complexes de signalisation macromoléculaire CFTR pour la signalisation spécifiques / sélective et efficace dans les cellules ^16-18.

Multiples dosages biochimiques ont été développées pour étudier la protéine CFTR-impliquant les interactions entre protéines, telles que la co-immunoprécipitation, pull-down assay, par paire test de liaison, colorimétrique paires test de liaison, et le dosage assemblage macromoléculaire complexe ^16-19,28,29 . Nous nous concentrons ici sur les procédures détaillées d'assemblage d'une PDZ motif-dépendante CFTR contenant macromoléculaire complexe in vitro, qui est largement utilisé par notre laboratoire pour étudier protéine-protéine ou un domaine à domaine interactions impliquant la protéine CFTR ^16-19,28,29.

Protocole

1. Expression et purification de protéines recombinantes de fusion associés à des bactéries

1. Amplification des régions définies du C-queue (les 50-100 derniers acides aminés contenant des motifs PDZ à extrémité C-terminale) pour CFTR, APL _2, MRP2, MRP4, β ₂ AR, et NHERFs (pleine longueur ou PDZ1 ou PDZ2 domaines ) par l'approche de PCR.
2. Cloner les produits de PCR en pGEX4T-1 vecteur de la TPS-protéines de fusion (comme la TPS-NHERFs, TPS-MRP4 CT), pMAL-C2 vecteur de protéines de fusion MBP (comme MBP-β ₂ AR CT, MBP-CFTR CT ), et pour ses pET30-S-protéines de fusion (tel que son-S-CFTR CT, Son-S-PDZK1).
3. Transformer dans un E. déficiente en protéase souche de E. coli (BL21-DE3) pour minimiser la dégradation possible de protéines recombinantes.
4. Cultiver la culture pendant une nuit à 37 ° C dans du milieu Luria-Bertani (pH 7,0) contenant des antibiotiques appropriés (tels que l'ampicilline ou la kanamycine). Diluer la culture de nuit à 1:10 et se développer pendant encore 2 h à 37 ° C. Dansduire avec 0,5-1 m M IPTG pour le prochain 4 h à 30 ° C. Pellet les cellules par centrifugation à 8000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
5. Lyse des cellules dans le tampon de saccharose (50 m M Tris-HCl, pH 8,0, 1 m M EDTA, 1 m M PMSF, et 10% de saccharose) contenant du lysozyme (1 mg / ml), 0,2% de Triton X-100, et de la protéase inhibiteurs. Utilisez 20 ml pour culot cellulaire provenant de 1 L de la culture.
6. Mélanger sur un agitateur rotatif pendant 30 min à 4 ° C.
7. Centrifuger à 20000 g pendant 30 min à 4 ° C. Recueillir le surnageant clair.
8. Dans le surnageant clair, ajouter 1 ml de résine les suivantes / agarose perles (coulis 50% dans le tampon de saccharose):
   • Glutathion billes d'agarose pour les protéines de fusion GST.
   • Talon perles pour Ses-S protéines de fusion.
   • Résine d'amylose pour les protéines de fusion MBP.
9. Mix pendant 4 h à 4 ° C sur un agitateur rotatif.
10. Laver les billes en remettant en suspension dans du PBS 1X (15 ml), mélanger pendant 2 min, tournant à 800 × g pendant 2 min, et élimination du surnageant. Répétez cette étape pour six fois.
11. Eluer la protéine à partir des billes en utilisant un tampon d'élution respectifs (2 ml de tampon d'élution pour 1 ml de billes).
    • Tampon d'élution des protéines de fusion GST: 25 m M Tris-HCl (pH 8,0), 140 m M de NaCl, et 20 m M glutathion réduit.
    • Tampon d'élution pour ses protéines de fusion: 20 m M Tris-HCl (pH 8,0), à 500 m M de NaCl, et à 200 m M d'imidazole.
    • Un tampon d'élution pour des protéines de fusion MBP: 20 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 200 m M de NaCl, 1 m M d'EDTA, de 1 m M DTT, et 10 m M maltose.
12. Dialyser les protéines éluées contre 2 L de PBS 1x à 4 ° C (pour éviter la dégradation des protéines du possible). Changer PBS toutes les 4 h, quatre fois. Concentrer la protéine à l'aide d'un filtre Centricon (10.000 MW de coupure, Millipore) et le magasin en tant que de petites aliquotes à -80 ° C.
13. Dethermine de la concentration en protéines par la méthode de Bradford. Évaluer la qualité des protéines par SDS-PAGE en utilisant la BSA comme normes. Si l'intégrité de la protéine n'est pas satisfaisante, les procédures de purification secondaires telles que la filtration sur gel ou d'échange d'ions peut être utilisé. (Par exemple, nous avons utilisé une colonne G-75 Sepharose pour purifier davantage la TPS-protéine de fusion).

2. Culture cellulaire et préparation lysat cellulaire

1. Culture rein de bébé hamster (BHK) que de manière stable sur-expriment la protéine CFTR-poids et _CFTR-his10 ou des cellules BHK que transitoirement sur-expriment le drapeau-APL _2-poids ou Drapeau-APL _2-ΔSTL, et Madin-Darby Canine Kidney (MDCK cellules) que de manière stable sur-express MRP2 à Eagle du milieu essentiel minimum (MEM) contenant 10% sérum de veau foetal et de la pénicilline / streptomycine dans des flacons en polystyrène à 37 ° C avec 5% de CO _2.
2. Culture embryonnaires humaines de rein 293 (HEK293) des cellules qui expriment de manière stable sur-CFTR-poids et _CFTR-his10 dans Dulbecco«Moyen s de Eagle modifié (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin et de la pénicilline / streptomycine dans des flacons en polystyrène à 37 ° C avec 5% de CO _2.
3. Lyse des cellules dans le tampon de lyse (PBS - 0,2% de Triton-X-100 complété par un mélange d'inhibiteurs de la protéase contenant 1 m M phénylméthylsulfonyle fluorure, 1 ug / ml d'aprotinine, 1 ug / ml de leupeptine, 1 ug / ml de pepstatine); utilisation 500 ul de tampon de lyse pour chaque plat de 60 mm de Petri, et 1000 ul de tampon de lyse pour chaque plat de 100 mm de Petri.
4. Rock the lysats cellulaires pendant 20 min à 4 ° C, et de supprimer l'insoluble par centrifugation à 16.000 g pendant 15 min à 4 ° C. Déterminer la concentration en protéines par la méthode de Bradford.

3. Assemblage in vitro d'un complexe macromoléculaire CFTR contenant (CFTR-PDZK1-MRP4)

1. Dans 200 ul de tampon de lyse (PBS - 0,2% de Triton X-100 + inhibiteurs de la protéase), ajouter 20 pg purifiée GST-MRP4-C-terminal50 bis (CT50) protéine de fusion.
2. Additionner les montants différents (0-40 mg) de purifier Son-S-PDZK1 protéine de fusion.
3. Mélanger les deux protéines sur un mélangeur rotatif à 22 ° C pendant 1-2 h.
4. Ajouter 20 billes de glutathion pi (50% suspension) dans le mélange de protéines, et continuer à mélanger pour un autre h 1. Cette étape est aussi appelée par paire de liaison.
5. Pendant ce temps, préparer les lysats cellulaires HEK293 qui surexpriment la protéine CFTR-Drapeau (en poids) tel que décrit ci-dessus à l'étape 2).
6. Laver le complexe à deux reprises avec un tampon de lyse. Centrifuger à 800 xg pendant 1 min pour chaque lavage et aspirer délicatement le surnageant après chaque lavage. Faites preuve de prudence pour ne pas sucer les billes dans le fond.
7. Ajouter les HEK293 préparés ci-dessus lysats cellulaires aux billes, et mélanger délicatement à 4 ° C pendant 3 h (ou toute la nuit).
8. Laver les billes extensive trois fois avec un tampon de lyse telles que décrites à l'étape 3.6).
9. Éluer les protéines en utilisant 30 uL tampon d'échantillon (5 ×): 0,6 M Tris-HCl (pH 6,8), glycérol 50%, 2% de SDS, et 0,1% de bleu de bromophénol, contenant 5% β-mercaptoéthanol.
10. Incuber à 37 ° C bain-marie pendant 10-15 min, et de spin à 5000 × g pendant 30 s pour précipiter les perles.
11. Chargez tous l'éluat sur un gel de 4-15%.
12. Exécuter SDS-PAGE pour environ 30-40 min.
13. Transfert des bandes de protéines à la membrane PVDF, pendant 1,5 heures.
14. Bloquer la membrane dans du TBS-Tween contenant 5% de matière grasse du lait non.
15. Incuber la membrane avec l'anticorps primaire (comme les anti-IgG CFTR, R1104) à 4 ° C, pendant la nuit.
16. Laver la membrane avec du TBS-Tween pendant 5 min, à six reprises.
17. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire (par exemple la chèvre anti-souris conjugué à HRP 2 anticorps ^e) pendant 45 min à 22 ° C.
18. Laver la membrane avec du TBS-Tween pendant 5 min, à six reprises.
19. Visualisez les bandes de protéines par ECL.
20. Les données représentatives sont présentés dans la figure 1.

jove_title "> 4. Les résultats représentatifs

Un exemple de complexe macromoléculaire contenant du CFTR de signalisation qui a été assemblé in vitro est représenté sur la figure 1. Un complexe macromoléculaire a été formé entre MRP4 C-terminales de 50 acides aminés (MRP4-CT50), les PDZK1 et pleine longueur du gène CFTR (figure 1, en ​​bas). La formation d'un complexe augmentation de la dose-dépendante avec des quantités croissantes de la protéine intermédiaire, PDZK1 (Figure 1, en ​​bas) ^18.

Figure 1. La représentation graphique de l'analyse complexe macromoléculaire (en haut). Un complexe macromoléculaire a été détectée in vitro avec trois protéines (TPS-MRP4-CT50, Son-S-PDZK1, et Flag-CFTRwt) d'une manière dose-dépendante (en bas) ^18.

	CFTR-NHERF1-β 2 AR (réf. 14)	CFTR-NHERF2-APL 2 (réf. 15)	CFTR-PDZ protéines-MRP 2 (réf. 17)	CFTR-PDZK1-MRP4 (réf. 16)
Perles d'affinité	Résine d'amylose	S-protéine d'agarose	Résine d'amylose	Le glutathion agarose
Protéine purifiée-1	MBP-β 2 AR CT	Son-S-CFTR CT	MBP-CFTR CT	TPS-MRP4 CT
Protéine purifiée-2	TPS-NHERF1	TPS-NHERF2	TPS-PDZ protéines	Son-S-PDZK1
Protéine purifiée-3 (ou lysats cellulaires)	CFTR-poids ou CFTR-his10 (BHK ou lysats cellulaires HEK)	DrapeauLPA-2-poids ou Drapeau-APL 2-ΔSTL (lysats cellulaires BHK)	MRP2 (lysats de cellules MDCK)	Purifiée Drapeau-CFTR-poids ou CFTR-his10 (ou lysats cellulaires)
Anticorps	Anti-IgG CFTR	Anti-Flag HRP	Anti-IgG MRP2	Anti-Flag HRP

Tableau 1. Résumé des différents complexes macromoléculaires CFTR contenant assemblés in vitro.

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Discussion

Dans ce protocole, nous avons démontré une méthode in vitro le montage et la détection d'une protéine CFTR contenant un complexe macromoléculaire de signalisation utilisant des protéines purifiées (ou fragments de protéines) et / ou de lysats cellulaires comme indiqué précédemment ^16-19,29,30. Pour obtenir les meilleurs résultats sur les points suivants critiques au cours du processus de préparation nécessitent une attention particulière:

• Il est important que le pH du...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Le numéro de catalogue	Commentaires
pGEX4T-1 vecteur	GE Healthcare	28-9545-49	anciennement Amersham Biosciences
pMAL-C2 vecteur	New England Biolabs
pET30 vecteur	EMD Chemicals	69077-3	anciennement Novagen
Glutathion billes d'agarose	BD Biosciences	554780
Résine d'amylose	New England Biolabs	E8021S
Perles Talon	Clontech	635501
glutathion réduit	BD Biosciences	554782
imidazole	Pêcheur	BP305-50
maltose	Pêcheur	BP684-500
S-protéine d'agarose	EMD Chemicals	69704-3	anciennement Novagen
Anti-Flag HRP	Sigma	A8592
Anti-IgG CFTR	Fait sur mesure	R1104	mAb reconnaissant CFTR épitope à aa 722-734
Anti-IgG MRP2	Chemicon International	MAB4148	Maintenant une partie de Millipore