דגם של עירוי מזין כרוני בחולדה

Summary

פרוטוקול לחליטות כרוניות של גלוקוז וIntralipid בחולדות מתואר. מודל זה יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של עודף חומרי מזון על תפקוד איברים ופרמטרים פיסיולוגיים.

Abstract

חשיפה כרונית לרמות מופרזות של חומרים מזינים הנחה היא להשפיע על הפונקציה של מספר איברים ורקמות ולתרום להתפתחות של סיבוכים רבים הקשורות להשמנה ותסמונת המטבולית, כולל סוכרת מהסוג 2. כדי לחקור את המנגנונים שבאמצעותם רמות עודפות של גלוקוז וחומצות שומן משפיעות על התא בטא בלבלב ואת הפרשת האינסולין, הקמנו מודל עירוי תזונתי כרוני בעכברים. ההליך מורכב מcatheterizing וריד הצוואר הימני ועורק הצוואר שמאלי תחת הרדמה כללית, המאפשר תקופת החלמה של 7 ימים; חיבור צנתרים למשאבות באמצעות מערכת המאפשרת משקל נגד בעלי החיים לנוע בחופשיות בכלוב ומסתובב, ויציקה גלוקוז ו / או Intralipid (תחליב שמן סויה שיוצר תערובת של כ -80% unsaturated/20% חומצות שומן רוויים, כאשר חדורים עם הפרין) ל72 שעות. מודל זה מציע כמה AdvantaGES, כולל אפשרות דק לווסת את רמות הגלוקוז ביעד של מחזור וחומצות שומן; האפשרות לשתף להחדיר תרכובות תרופתיות, ומסגרת הזמן הקצרה יחסית, בניגוד למודלים תזונתיים. ניתן להשתמש בו כדי לבחון את המנגנונים של תפקוד הנגרם תזונתי במגוון רחב של איברים ולבדוק את היעילות של תרופות בהקשר זה.

Introduction

רמות גבוהות כרוני של גלוקוז ושומנים במחזור הדם הוצעו לתרום לפתוגנזה של סוכרת מהסוג 2 על ידי שינוי הפונקציה של מספר איברים המעורבים בשמירה על הומאוסטזיס הגלוקוז לרבות, אך לא רק, התא בטא בלבלב (הנסקרת ב ^1). יוצא מתוך ההנחה שההשערה glucotoxicity היפרגליקמיה כרונית מחמירה את פגם התא בטא שהוליד היפרגליקמיה במקום הראשון, ובכך יוצרים מעגל אכזרי ותורם להידרדרות של בקרת הגלוקוז בחולי סוכרת מהסוג 2. כמו כן, מוצעת כי השערת glucolipotoxicity גבהים קשורים של רמות הגלוקוז ושומנים בדם, כפי שנצפו לעתים קרובות בסוכרת מהסוג 2, הם מזיקים לתאי בטא.

פענוח המנגנונים התאיים ומולקולריים של ההשפעות המזיקות של חומרים מזינים כרוני גבוהים על תפקוד תא בטא בלבלב הוא מפתח לunderstanding של פתוגנזה של סוכרת מהסוג ¹ 2. לשם כך, מספר רב של מחקרים שבחן את המנגנונים של vivo לשעבר העודף התזונתי הכרוני באיים לנגרהנס מבודדים או במבחנה בשורות תאים משובטות, אינסולין. עם זאת, התרגום של הממצאים שהתקבלו במערכות מודל אלה כדי האורגניזם כולו הוא מורכב, בפרט משום שהריכוזים של חומצות שומן המשמשות בתאים או באיים בתרבית לעתים רחוקות להתאים את הרמות במחזור בקרבת תאי הביתא בvivo ^2. מצד השני, את המנגנונים של כישלון תא בטא בתגובה לעודף חומרי מזון נבדקו במודלים של מכרסמים של סוכרת, כפי שהודגם על ידי צוקר חולדת ^3,4 שומן סוכרתי, הגרביל Psammomys obesus ⁵ ועתיר שומן הדיאטה הפד עכבר ^6. מודלים אלה, לעומת זאת, מאופיינים בהפרעות מטבוליות פנימיות ולא בקלות נוחה למניפולציות של גלוקוז בדםו / או רמות שומנים בסביבה יותר מבוקרת ופחות כרונית. כדי להיות מסוגל לשנות את רמות חומרים המזינים במחזור בפרק זמן של ימים בבעלי חיים נורמלים בדרך כלל, פיתחנו מודל עירוי כרוני בחולדות נורמליות אשר מאפשר לנו לבחון את ההשפעות של שומנים וסוכר, לבד או בשילוב, על פרמטרים ותפקוד פיסיולוגיים ^7,8.

Protocol

סקירה: ההליך מורכבת catheterizing וריד הצוואר הימני ועורק הצוואר שמאלי תחת הרדמה כללית, המאפשר תקופת החלמה של 7 ימים; חיבור צנתרים למשאבות באמצעות מערכת המאפשרת משקל נגד בעלי החיים לנוע בחופשיות בכלוב מסתובב ו; ויציקת גלוקוז ו / או Intralipid (תחליב שמן סויה שיוצר תערובת של כ -80% unsaturated/20% חומצות שומן רווי, כאשר חדור הפרין ⁹⁾ עבור 72 שעות.

1. Canulation של עורק הצוואר הימני ועורק צוואר השמאלי

1. לעקר מכשירי ניתוח. צינורות Canulation גם חייבים להיות קר עיקור באמצעות סוכן נוזל חיטוי (2.6% glutaraldehyde) לפני ההליך. לטבול את הצינור במכל autoclaved ל16-24 שעות. יש לשטוף ולשטוף ביסודיות במים מזוקקים סטריליים כדי להסיר את כל העקבות של glutaraldehyde לפני השימוש.
2. לשקול את החולדה לחישובמינוני תרופות:
   Carprofen 5 מ"ג / ק"ג: דילול 1/10 = משקל גוף (g) x 0.001 מ"ל SC (משכך כאבים)
   Glycopyrrolate 0.01 מ"ג / ק"ג: דילול 1/10 = BW (ז) X 0.0012 מ"ל SC (אנטיכולינרגיות)
3. הרדימי עכברוש באמצעות isoflurane וחמצן.
4. מניחים את החולדה על הבטן שלה. לגלח את האזור שמאחורי האוזניים לבסיס של הכתפיים. הנח את העכבר על גבו. לגלח את האזור מתחת לצוואר לרגליו הקדמיות.
5. הכינו את האתר כירורגית עם כלורהקסידין, אלכוהול, ויוד. לנהל תרופות.
6. העבר את העכבר לשדה הניתוח.
7. באמצעות טכניקת aseptic, canulate וריד הצוואר הימני ועורק הצוואר השמאלי וPE-50 canula מצורף מזרק 1 מ"ל מלא 5 U של מלח heparinized. לשטוף את canulas עם 50 U של מלח heparinized כדי למנוע קרישה במהלך תקופת ההחלמה. משתמש במחטי 23G קהות. סגור את כל canula עם סיכת 23G.
8. לאחר הניתוח, לקצץ כ 2.5 מ"מ מעלחותכות תחתונות ומניח את החולדה במעייל עירוי כדי למנוע את canulas מנאכל.
9. לספק חמצן (1 ליטר / דקה למשך 10 דקות) כדי לסייע בפינוי isoflurane.
10. מניחים את החולדה בכלוב מחומם עד שהוא ער לחלוטין.
11. פועל ארבע חולדות לשימוש אחד לכל מצב עירוי (טבלת 1).

2. טיפול שלאחר הניתוח (טיפול לאחר הניתוח וחיבור של צנתרים)

1. לשקול את החולדות ביום 1 ויום 2 שלאחר ניתוח.
2. לנהל glycopyrrolate (BW (g) x .00048 מ"ל) SC פעמיים ביום שלאחר הניתוח 1 ופעם אחת ביום שלאחר הניתוח 2.
3. יכולים להינתן טיפולים תומכים נוספים במידת צורך: נוזלים, כרית חימום, תזונה רטובה, טיפול בחמצן, משככי כאבים, anticholinergics.
4. ביום שלאחר ניתוח 7, לשקול את החולדות כדי לחשב את ספיקות לעירוי.
5. חברו כל חולדה למערכת באמצעות עירוי לקשור ומסתובב רכוב על גבי גריל כלוב (איור 1).
6. לשטוף את canulas עם 5 U של מלח heparinized להסיר קרישים. לשטוף את canulas פעם נוסף עם 50 U של מלח heparinized כדי למנוע קרישה.
7. לאפשר לחולדות להסתגל לרצועה ומסתובבת במשך לפחות 24 שעות לפני תחילת העירוי.

3. אינפוזיה

1. צייר 0.15 מ"ל של דם מצווארו של כל glycemia חולדה ולמדוד. לשטוף את canulas הצוואר. השתמש 50 U של מלח heparinized למניעת קרישה בשני canulas של כל חולדה.
2. להעביר את דגימת הדם לצינור איסוף 0.5 מ"ל מכיל 2% EDTA. צנטריפוגה ב 10,000 סל"ד במשך 2 דקות ולהקפיא את הפלזמה ב -20 ° C.
3. מלא שני מזרקים 60 מ"ל לכל אחד מהתנאים המפורטים להלן העירוי. מקום 1 מזרק בעמדה הקדמית של המשאבה ומזרק המקום 2 בעמדה האחורית של המשאבה.
4. הצטרפות כל זוג של פתרונות יחד עם y-מחברים וצינורות T22 CO-EX שכבר מעוקר. מניחים את המזרקים ברווארד 33משאבת מזרק כפולה.
5. שנה את תחתית הכלוב ולהסיר את כל האוכל מלמעלה כלוב הגריל.
6. שוקל 150 גרם של רמת אוכל ומניח על גבי גריל הכלוב.
7. לחבר את המזרקים למסתובבים על גריל הכלוב. לשטוף את המזרקים כמו שצריך להסיר את האוויר שנלכד מהקווים.
8. לחשב את ספיקות העירוי תוך שימוש במשקל הגוף שנלקח לפני חיבור העכבר למערכת העירוי. מחירים מחושבים עם קובץ Excel של מיקרוסופט שממיר קצב עירוי גלוקוז (Gir) למ"ל / שעה.
9. הגדר את המשאבה לנהל ספיקות עבור 60 מ"ל מזרקים בהתאם להגדרות היצרן. הזן את השיעור למזרק 1 (מזרק קדמי) והמחיר למזרק 2 (חזרה מזרק).
10. התחל את המשאבה.

4. ניטור

1. לאחר הפעלת המשאבה, לוודא שאין דליפה ממסתובבת או מcanulas וצינורות עירוי שאינו מעוות. כמו כן לוודא שאין בועות אוויר בצינורות.
2. לאחר 3 שעות של עירוי, לקחת דגימת דם כדי לפקח glycemia. חזור אחרי 6, 24, 48, ו -72 שעות של עירוי. כאמצעי זהירות, glycemia גם מעקב אחרי 30, 34, 54, ו -60 שעות של העירוי. רמת סוכר בדם ניתן למדוד באמצעות טיפה אחת של דם כל שימוש במסך גלוקוז נייד. זה מגביל את כמות הדם שנלקחה במהלך העירוי, ולכן נמנע משינוי באופן משמעותי נפח דם ו / או המטוקריט.
3. השיעור למזרק 1 הוא שונה המבוסס על ערכי glycemia כדי לשמור על רמת סוכר בדם ב220-250 מ"ג / ד"ל. השיעור למזרק 2 אינו משתנה במהלך שעות 72 של עירוי כי חומצות שומן חופשיות נשמרות במילימול 1 / ל '
4. תנאי עירוי הם לזווג כך שהנפח קיבל לפקד החיים הוא שווה ערך להיקף קיבל לבעלי החיים הבדיקה (טבלת 1).
5. לאחר 24 שעות של עירוי, לשנות את תחתית הכלוב ולשקול את המזון שנותר בגריל הכלוב. לחזור לא חלק שלא נאכלo גריל הכלוב. חזור אחרי 48 שעות.
6. מזרקים מילוי יומיים כנדרש בשעה 72 בעירוי.
7. במהלך העירוי, תמיד לבחון את החולדה לכל סימנים של דלקת או אי נוחות. לנהל טיפול מתאים במידת צורך.

5. המתת חסד לאחר העירוי

1. לאחר 72 שעות של עירוי, חולדות מורדמים הווריד עם 0.5 מ"ל של קוקטייל קטמין / xylazine (182 מ"ג / ק"ג של קטמין ו11.6 מ"ג / ק"ג של xylazine דילול 01:02 עם 0.9% NaCl).
2. רפלקס הבוהן קמצוץ משמש כדי לוודא את רמת ההרדמה. חומר הרדמה נוסף מנוהלת בהתאם לצורך.
3. כאשר החולדה הוא הרדים, חלל הבטן נפתח עם מספריים כירורגיות. חולדת exsanguinated על ידי ציור 10-15 מ"ל של דם במזרק מאב העורקים או הווריד הנבוב.

תוצאות

מתוך סדרה של 42 חולדות שעברו ניתוח, 5 חולדות איבד במהלך התקופה שלאחר הניתוח והעכברוש 1 אבד במהלך העירוי, המייצג את שיעור הצלחה כולל של 86%. משקל הגוף הממוצע של 37 חולדות שסופו של דבר היה חדור 608 ± 5 גרם לפני הניתוח ו588 ± 6 גרם ביוזמתו של העירוי (ממוצע ± SE, n = 37, P <0.0001 ידי לזווג מ?...

Discussion

למרות שמספר מחקרים קודמים הועסק חליטות כרוניות של גלוקוז (לדוגמא ^10-15) או שומנים (למשל ^16,17) במכרסמים, למיטב ידיעתנו העירוי המשולב של שני הדלקים דווח רק בעכברי ^18. מודל העירוי הכרוני המוצג כאן מציע מספר יתרונות כדי לחקור את ההשפעות על עודפים תז?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline 0.9%	BD	JB1324
Dextrose 70%	McKesson
Intralipid 20%	Fresenius Kabi	JB6023
Metricide (Glutaraldehyde 2.6%)	Metrex	11-1401
Heparin Sodium 10,000 USP u/ml	PPC
Carprofen	Metacam
Glycopyrrolate	Sandoz
Isoflurane	Abbott
Chlohexidine 2%
Alcohol 70%
Iodine
PE-50	BD	427411
CO-EX T22	Instech Solomon	BCOEX-T22
Connector 22G	Instech Solomon	SC22/15
Swivel 22G	Instech Solomon	375/22PS
Y-Connector 22G	Instech Solomon
Counterbalance and arm	Instech Solomon	CM375BP
23 G blunted needles	Instech Solomon	LS23
23 G canulation pins	Instech Solomon	SP23/12
Tethers (12 inch)	Lomir	RT12D
Infusion jackets	Lomir	RJ01, RJ02, RJ03, RJ04
(SM-XL)
Tether attachment piece	Lomir	RS T1
60 ml syringe	BD	309653
1 ml syringe	BD	309602