共培养影响胰腺β细胞的胰岛素分泌细胞外蛋白质相互作用分析

摘要

跨细胞蛋白质的相互作用是胰岛β细胞功能的重要决定因素。这里是详细的方法改编自突触调查特定的跨膜蛋白如何影响胰岛素的分泌模式的共存。转染的HEK293细胞中表达蛋白质的利益;不需要beta细胞被转染的或以其他方式直接扰动。

摘要

细胞表面蛋白之间的相互作用有助于协调相邻细胞的功能。胰岛β细胞胰岛细胞内聚集在一起，并以协调的方式采取行动，以维持血糖稳态。它正变得越来越清楚，相邻的β细胞表面的跨膜蛋白之间的相互作用是β细胞功能的重要决定因素。

阐明的角色击倒，击倒或过度表达β细胞培养或体内的研究，特别是跨细胞相互作用必须直接扰动mRNA和蛋白表达，可能会影响β-细胞的健康和/或功能的方式，可能混淆的影响分析具体的相互作用。这些方法还可以改变对象的蛋白质的细胞内结构域的水平，并可能防止蛋白质之间的相互作用的影响，由于在同一小区内的膜显示tinguished跨细胞的相互作用的影响。

这里，提出了一种用于确定特定的跨细胞的相互作用的效果的β细胞分泌胰岛素的能力和响应能力。此方法适用于β-细胞系，如INS-1细胞，并解离的主要beta细胞。共培养模型的基础上开发的神经生物学家，谁培养的神经元，以表达对HEK293细胞层（或COS）确定蛋白质的重要​​驱动突触形成的特定的神经元蛋白的发现，暴露。由于神经突触和β细胞分泌机械之间的相似之处，我们的理由是，类似的跨细胞相互作用，都可能被β-细胞功能成熟。我们开发了一种系统beta细胞上培养HEK293细胞中表达的蛋白质还一层。在这个模型中，β-细胞的细胞质，而细胞外的蛋白质 - 蛋白质interactio不变NS被操纵。虽然我们对葡萄糖刺激的胰岛素分泌的研究主要集中在这里，其他进程可以进行分析，例如，由免疫或定量PCR基因表达的变化。

引言

我们在这里描述的方法，以方便调查特定的跨膜蛋白的胞外结构域如何影响胰岛素的分泌。的方法探测感兴趣的蛋白质与蛋白质（或可能是其他分子）的胰腺β-细胞表面上的相互作用的影响。该方法允许调查的β细胞或其他邻近的细胞（ 如内皮细胞，神经细胞，胰腺α细胞）表达的细胞表面蛋白如何影响β细胞功能的通过跨细胞相互作用（ 即通过与相互作用伙伴的相互作用的表面上相邻的β细胞）。

的细胞的质膜中包含一系列复杂的结构和功能的蛋白质作为细胞外环境的桥梁。通过形成跨细胞连接或塑料信号事件开始，细胞表面蛋白之间的相互作用，可以帮助协调周边小区的功能。胰岛β细胞胰岛内聚集在一起，并以协调的方式采取行动，以维持葡萄糖稳 ​​态^1。所揭示的，例如，通过外EPHA ephrinA的neuroligin-2相互作用的葡萄糖刺激的胰岛素分泌的调节的重要性，它正成为越来越清晰的是，增加细胞外的蛋白质之间的相互作用的表面上相邻的知识β细胞，将是非常重要的胰岛素分泌，胰岛β细胞功能的成熟和维持血糖稳态^1-3获得一个全面的了解。这里描述的方法的目标是使跨细胞的相互作用，涉及特定的跨膜区或其它细胞表面相关蛋白的β细胞功能的影响的调查。 β细胞共培养HEK293细胞转染不同的表达结构，对b的影响〔η细胞的功能不同的细胞表面蛋白或突变的变种，其可以有效地探测。这是完成，无需转染β细胞本身。

阐明的角色击倒，击倒或过度表达β细胞培养或体内的研究，特别是跨细胞相互作用，必须直接微扰β细胞的mRNA和蛋白表达，有可能影响β细胞的健康和/或功能的方式，可能会混淆分析特定的细胞外的相互作用的影响。这些方法也改变的细胞内结构域的目标蛋白的水平，还不允许或跨细胞的相互作用的影响，以区别于在同一单元中的蛋白质之间的相互作用的影响。在这里，一种方法，用于确定特定的跨细胞的相互作用的效果的β细胞分泌胰岛素的能力和响应能力是叙述的离子束辅助沉积。本方法适用分泌胰岛素的β-细胞系，如INS-1细胞^4，并解离的主要啮齿动物或人类β细胞。它是基于共培养模型的神经生物学家，谁发现，暴露培养的神经细胞的特定的神经元蛋白表达对HEK293细胞层（或COS）开发可以识别该驱动器突触形成的蛋白质^5,6。由于神经突触和β细胞分泌机械之间的相似之处，我们的理由是，β细胞功能和功能成熟，都可能被类似的跨细胞相互作用^7-9。为了探测这些相互作用，我们开发了本文描述的系统，其中beta细胞层上的感兴趣的蛋白¹⁰表达的HEK293细胞共培养。这个系统允许的β-细胞的细胞质中保持不变，而细胞外的蛋白质 - 蛋白质相互作用被操纵。

研究方案

1。转HEK293层的

1. 准备HEK293细胞培养基，加入至500ml的瓶的DMEM（4.5克/毫升的葡萄糖和酚红，无谷氨酰胺）:50毫升胎牛血清，5毫升100X青霉素/链霉素溶液，5毫升100倍的L-谷氨酰胺的溶液和500μl的两性霉素B.
2. 板出在24孔板使用0.5毫升每口井的HEK293媒体的HEK293细胞。确保细胞均匀地分布在盘底。
3. 当达到100％汇合的转染HEK293细胞，用0.8μg的质粒的编码所述感兴趣的蛋白质（插入哺乳动物表达载体）和2μl脂质体2000的脂质体转染的协议。我们选择使用设计用于在哺乳动物细胞中表达了pcDNA 3.3骨干。
4. 或者，经过6小时的潜伏期，交流转媒体描述在脂质体转染协议正常HEK293媒体的。
5. 为了评价表达的转染PROTE，转染组织培养井的一个子集可用于免疫荧光检测所表达的蛋白质或免疫印迹分析蛋白的表达，用标准技术。

2。可选固定HEK293细胞转染蛋白表达

转染HEK293细胞，可以轻轻地固定，以促进共培养介质中可能是有害的生活HEK293细胞中（ 如下面的步骤3.9），或者允许一次全部板前几个实验的高效制备（见讨论）。

1. 进行试验研究，以确定在HEK293细胞中的蛋白质的表达的时间过程。
2. 在转染的HEK293细胞层的，吸媒体从细胞转染后的时间点与最高的表达水平相关。如果发生这种情况的第一个24小时内，不转染后吸出，直到24小时。
3. 洗净HE然后轻轻地用D-PBS K293细胞加入500微升4％多聚甲醛（PFA），并在室温下孵育30分钟。 （4％PFA的解决方案，16％的溶液在1X PBS开始用1X PBS稀释1:4）。
4. 使用无菌PBS，轻轻洗细胞3次，并培育在PBS O / N在4°C。
5. 洗涤细胞3次，用无菌PBS，再加入PBS和离开，在4°C，直到需要时（最大存储时间可能取决于对蛋白质的表达。存储HEK293细胞的转染表达的neuroligin亚型长达2周没有显着变化，观察效果胰岛素分泌）。

3。 INS-1β细胞共培养细胞系的

1. 准备INS-1，加入到500毫升的RPMI 1640（葡萄糖和酚红，无谷氨酰胺）:媒体50 5毫升100X毫升胎牛血清，青霉素/链霉素，5毫升100X L-谷氨酰胺溶液，5毫升丙酮酸钠，500微升两性霉素B，500微升β-巯基乙醇（这是几乎相同的Medi这个通常用于除加入β-巯基乙醇）原代胰岛培养。
2. 使用手机汽提塔（或其他的非酶细胞去除），收获INS-1细胞在约70-80％汇合的折扣的T75培养瓶的底部。 48口井，每个烧瓶中提供大致足够的细胞。
3. 纺丝后，细胞在离心3分钟，在1200 rpm，重悬在50/50的组合，INS-1和HEK媒体。对于70-80％汇合烧瓶INS-1细胞，重悬在约25毫升混合介质。
4. 如果使用HEK293细胞中已修复的多聚甲醛，而不是现场HEK293细胞，INS-1细胞悬浮在100％INS-1媒体而非混合介质。
5. 用10毫升移液管，从撞出细胞沉淀，使均匀的细胞悬浮液。
6. 吸移除媒体HEK293细胞。
7. 使用P1000吸管，轻轻INS-1细胞悬液加500微升到HEK细胞层两旁Øf为好。每6口井后，用10毫升吸管再次悬浮INS-1细胞，以确保细胞悬液均匀。共培养整体方案中的设置在图1中示出。
8. 细胞孵育24-48小时，取决于实验的协议。
9. 如果超过48小时共培养需要花多长时间，使用可选的步骤，在上述第2 HEK293细胞来修复。
10. 如果使用主解离的啮齿动物或人类胰岛[ 例如，参见事先协议朱庇特^11-15]，确保一个适当的介质，如RPMI用5ml笔/链球菌，5毫升L-过剩，0.5毫升两性霉素-B是用来代替INS-1媒体。虽然可以使用分离的胰岛细胞在24孔板，在实践中，因为潜在需要大量的胰岛，建议应考虑缩减到48孔板（每口井需要较少的胰岛细胞）。在48孔板，加入约100个​​小岛值得的解离泰德细胞每盘启动。根据对药效的离解，所使用的方法，可能需要较少的胰岛。

4。胰岛素分泌

1. 垫上预温育细胞在250μl的2.5 mM葡萄糖的Krebs-林格碳酸氢盐缓冲液（KRB）最少1小时。要垫上预温育，删除共存培养基，并立即更换KRB。这种交流应该做了一个很好的时间，以尽量减低环境氧INS-1细胞。吸用一只手吹打低（2.5毫米）与其他葡萄糖KRB。
2. 外汇预孵育的KRB到250μl的2.5毫米或20 mM葡萄糖的KRB缓冲液以及在一个时间。
3. 如果适合于特定的实验中，可能会增加额外泌剂，如100μMIBMX，以产生一个更强大的刺激的胰岛素分泌反应。特别是游离主胰岛β细胞反应不佳的葡萄糖浓度增加ALONE，所以在这里特别IBMX或其他泌此外应考虑^16,17。
4. 经过1小时的潜伏期，媒体转移到离心管和旋转1500 XG 5分钟。
5. 取出200μl的上清液，并使用该胰岛素RIA或ELISA法进行分析。
6. 以制备细胞裂解液，将100μlRIPA细胞裂解缓冲液（150 mM氯化钠，1.0％IGEPALCA-630或诺乃P-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS的50mM Tris，pH 8.0）中与蛋白酶抑制剂的加板取出后，立即媒体和孵化，在4℃20分钟。
7. 自旋向下的溶胞产物在10,000×g 15分钟，并取出50微升上清液胰岛素RIA或ELISA分析。

结果

使用这里介绍的方法，我们已经测试的效果不同的变种，对胰岛素分泌的蛋白质的neuroligin。这补充了我们的neuroligin-2 ^10β细胞功能的影响调查工作。例如， 图2中 ，示出从INS-1 beta细胞共培养的结果与转染的HEK293细胞来表达的neuroligin亚型这里称为NL十这个实验的目的是检验这一假设，NL-X从事跨细胞的相互作用，增加胰岛素的分泌。在图2A中可以看出，基底和NL-X的?...

讨论

在共存这里描述的方法提供了一种有效的方法，以确定特定的β-细胞表面的跨膜蛋白的生理重要性，特别是其胞外结构域。通过培养beta细胞或胰岛素瘤细胞（如这里的INS-1细胞）的HEK293细胞的接触显示感兴趣的在细胞表面上的蛋白质，可设计实验，以确定影响细胞外的蛋白质 - 蛋白质相互作用，而无需直接扰乱的细胞的细胞内环境。由于感兴趣的蛋白质表达的HEK293细胞，可以介导的转染的细胞内?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
pcDNA 3.3 vector/backbone	Invitrogen	K830001
Lipofectamine 2000	Invitrogen	18324012
DMEM	Mediatech	45001-312
Pen/strep solution	Mediatech	45001-652-1
Amphotericin B	Mediatech	45001-808-1/30
RPMI-1640	Mediatech	45001-404
D-PBS	Mediatech	45001-434
Sodium Pyruvate	Mediatech	45001-710-1
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985023
Cell stripper	Mediatech	45000-668
T75 Flask	BD	1368065
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50980487
10X PBS	Mediatech	45001-130
Fetal bovine serum	Mediatech	MT35010CV
IBMX	Sigma	I5879-100MG
RIPA lysis buffer	Sigma	R0278