Pankreas Beta Hücreleri ile insülin salgılanması Etkileyen Ekstrasellüler Protein etkileşimleri kokültürü Analizi

Özet

Transsellüler protein etkileşimleri pankreatik beta hücre fonksiyonu önemli belirleyicidir. Burada ayrıntılı bir yöntem uyarlanmış özel transmembran proteinler insülin salgılanmasını nasıl etkilediğini araştıran sinaptogenez-için bir kokültürü model. Transfekte edilmiş HEK293 hücreleri ilgili proteinlerin ifade eder; beta hücreleri transfekte edilmiş veya başka şekilde doğrudan tedirgin gerekmez.

Özet

Hücre yüzey proteinleri arasındaki etkileşim, komşu hücrelerin fonksiyonu koordine yardımcı olur. Pankreas beta hücreleri pankreas adacık içinde bir araya kümelenmiş ve glikoz dengesini korumak için koordineli bir şekilde hareket edilir. Bu komşu beta hücrelerinin yüzeylerinde transmembran proteinler arasındaki etkileşimleri beta-hücre fonksiyonu önemli belirleyicileri olduğu giderek daha açık hale gelmektedir.

Kültür beta hücreleri veya in vivo olarak demonte, knockout ya da aşırı çalışmalarla özellikle transsellüler etkileşimlerinin rol izahı potansiyel etkileri analiz karıştırabileceklerinden edemeyeceği şekilde beta hücresi, sağlık ve / veya fonksiyonunu etkileyen, mRNA ve protein ekspresyonu, doğrudan pertürbasyon gerektiren spesifik etkileşimler. Bu yaklaşım, aynı zamanda hedef proteinlerin hücre içi etki düzeyleri değiştirebilir ve dis olmak için aynı hücre zarı içindeki proteinler arasındaki etkileşimlere bağlı etkileri önleyebilirtranssellüler etkileşimlerin etkileri bir biçimde ayrılır.

Burada beta hücrelerinin insülin salgılayan kapasitesi ve yanıt belirli transsellüler etkileşimlerin etkilerini belirlemek için bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem, INS-1 hücreleri gibi beta-hücre hatları, ve ayrışmış primer beta hücreleri için de geçerlidir. Bu HEK293 (veya COS) sinaps oluşumu sürüş için önemli hücre tabakaları tespit proteinler üzerinde ifade belirli nöronal proteinlere kültürlü nöronların maruz kalma bulundu neurobiologists, tarafından geliştirilen kokültürü modelleri dayanmaktadır. Nöronal sinapsların ve beta hücrelerinin salgı makine arasındaki paralellikler göz önüne alındığında, beta-hücre olgunlaşması benzer transsellüler etkileşimleri ile tahrik olabilir gerekçeli. Biz beta hücreleri ilgi bir protein ifade eden HEK293 hücreleri bir tabaka üzerinde kültive edildiğinde, bir sistem geliştirilmiştir. Bu modelde, beta hücre sitoplazması dokunulmamış bir hücre dışı protein-protein ETKİLEŞİM ikenns manipüle. Öncelikle glikoz ile uyarılan insülin sekresyonunda çalışmalar burada odak rağmen, diğer işlemler analiz edilebilir, örneğin, gen ekspresyonunda değişmeler gibi immünolojik veya QPCR tarafından belirlenir.

Giriş

Burada belirli bir transmembran proteinin hücre dışı etki insülin salgılanması nasıl etkilediğini araştırmalar kolaylaştırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Pankreatik beta hücre yüzeyi üzerinde proteinler (veya muhtemelen diğer moleküller) ile söz konusu protein etkileşimleri gibi bir yöntem problar etkiler. Gibi bir yöntem beta hücreleri tarafından veya diğer komşu hücreler (örneğin, endotel hücreleri, nöronlar, pankreatik alfa hücreleri) ifade eden hücre yüzeyi proteinlerinin transsellüler etkileşimler (örneğin, komşu yüzeyinde etkileşim ortakları ile etkileşim yoluyla yoluyla beta hücresi fonksiyonunu etkileyebilir nasıl araştırmalar sağlar: beta hücreleri).

, Hücresel plazma membranında hücre dışı ortam arasında bir köprü olarak hizmet veren yapısal ve fonksiyonel proteinlerin kompleks bir dizi içerir. Transsellüler bağlantı oluşumu ile ya da plastik sinyal olaylarını başlatılarak, hücre yüzeyi proteinleri arasındaki etkileşimi koordine yardımcı olabilirKomşu hücrelerin fonksiyonu. Pankreas beta hücreleri pankreas adacık içinde bir araya kümelenmiş ve glikoz dengesini ¹ korumak için koordineli bir şekilde hareket edilir. Hücre dışı epha-ephrinA ve glikoz ile uyarılan insülin salgılanmasının düzenlenmesinde neuroligin-2 etkileşimlerinin önemi, örneğin, ortaya çıkardı, bu daha da açık hale gelmektedir, bitişik yüzeyleri üzerinde proteinler arasında meydana gelen hücre dışı etkileşimler artan bilgi beta hücreleri insülin salgılanması, beta hücre fonksiyonel olgunlaşması ve ^1-3 glikoz dengesinin bakım tam bir anlayış kazanmak için büyük önem taşıyacaktır. Burada açıklanan yöntemin amacı, belirli bir transmembran veya başka şekilde-hücre yüzeyi ile ilişkili proteinler içeren transsellüler etkileşimleri beta hücre fonksiyonu üzerindeki etkileri araştırmalar sağlamaktır. Farklı ifade yapıları ile transfekte HEK293 hücreleri, B üzerindeki etkileri ile birlikte-kültür beta hücreleri tarafındanFarklı hücre yüzey proteinleri ya da mutasyona uğramış varyantları eta hücre fonksiyonu bunların etkin bir şekilde araştırılabilir. Bu beta hücreleri transfekte etmek için kendilerini kalmadan gerçekleştirilir.

Kültür beta hücreleri veya in vivo olarak demonte, knockout ya da aşırı çalışmalarla özellikle transsellüler etkileşimlerinin rol izahı potansiyel analizi etkilemesi için değişik şekillerde beta hücre sağlık ve / veya fonksiyonunu etkileyen, beta hücresi mRNA ve protein ekspresyonu, doğrudan pertürbasyon gerektiren özel hücre dışı etkileşim etkileri. Bu, aynı zamanda, hedeflenen proteinlerin hücre içi etki düzeyleri değiştirmek ve daha fazla, transsellüler etkileşimlerin etkileri ayırt edilmesi ya da aynı hücrede protein arasındaki etkileşimlere bağlı etkileri izin vermez yaklaşır. Burada, beta-hücrelerinin insülin salgılayan kapasitesi ve yanıt belirli transsellüler etkileşimlerin etkilerini belirlemek için bir yöntem olup DescriIBED. Bu yöntem, INS-1 hücreleri, ⁴ gibi insülin salgılayan beta-hücre hatları, ve ayrışmış primer veya kemirgen, insan beta hücreleri için de geçerlidir. Bu HEK293 (veya COS) hücre katmanları ifade belirli nöronal proteinlere kültürlü nöronların maruz kalma bulundu neurobiologists, tarafından geliştirilen kokültürü modelleri dayandığını sürücü sinaps oluşumu ^5,6 proteinleri tespit olabilir. Nöronal sinaps salgı makine arasında ve beta hücrelerinin paralellikler göz önüne alındığında, beta-hücre fonksiyonu ve fonksiyonel olgunlaşma benzer transsellüler etkileşimleri ^7-9 ile tahrik olabilir gerekçeli. Bu etkileşimler prob amacıyla, beta hücreleri ilgi ¹⁰ bir protein ifade eden HEK293 hücreleri bir tabaka üzerinde kültüre edildiği tarifnamede açıklanan sistem geliştirilmiştir. Bu sistem, hücre-dışı protein-protein etkileşimleri manipüle edilir ise, beta hücre sitoplazması bakir kalmasını sağlar.

Protokol

1. HEK293 Katman Transfeksiyon

1. 50 ml FBS, 5 ml 100X Penisilin / streptomisin solüsyonu, 5 ml 100x L-glutamin solüsyonu ve 500 ul amfoterisin: DMEM 500 ml'lik şişelerde (4.5 ug / ml glükoz, fenol kırmızısı ile ve glutamin olmadan) ekleyerek HEK293 hücre ortamı hazırlayın B.
2. De başına HEK293 medya 0.5 ml kullanarak 24 plaka HEK293 hücreleri plaka. Hücrelerin plakanın alt üzerine yayılıyor emin olun.
3. HEK293 hücreleri plazmid Lipofectamine protokolüne uygun olarak ilgi duyulan proteini (bir memeli ifade vektörünün içine) ve Lipofectamine 2000 2 ul kodlama 0.8 mikrogram ile% 100 birbirine karışmış, transfekte ulaşır. Biz memeli hücrelerinde ifade için tasarlanmış pcDNA 3.3 omurga kullanmak için seçtiniz.
4. İsteğe bağlı olarak, 6 saat inkübasyon sonrasında değişimi transfeksiyon ortamı normal HEK293 ortam ile Lipofektamin protokolde tarif edildiği.
5. Transfekte prote ifade değerlendirmekolarak, transfekte edilmiş doku kültürü gözenekli bir alt kümesini ifade edilen protein immunofloresans tespiti için ya da standart teknikler kullanılarak protein ekspresyonu, Western blot analizi için kullanılabilir.

2. HEK293 hücreleri isteğe bağlı fiksasyonu Transfekte protein ifade

Transfekte HEK293 hücreleri hafifçe HEK293 hücreleri (örneğin aşağıda adım 3.9) yaşayan veya (ayrıca Tartışma) tek seferde birçok deneyler için plakaların önceden etkin hazırlık sağlamak için zararlı olabilir medyada kokültürü kolaylaştırmak için sabitlenebilir.

1. HEK293 hücrelerinde protein ifade zaman ders belirlemek için pilot çalışmalar yapmak.
2. HEK293 hücre tabakası transfecting sonra, ifade en üst düzeyde ilişkili sonrası transfeksiyon zaman noktasında hücrelerden medya aspire. Bu ilk 24 saat içinde meydana gelirse, transfeksiyondan 24 saat sonra aspire kadar yoktur.
3. HE YıkamaYavaşça D-PBS ile K293 hücreleri daha sonra 500 ul% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. (% 4 PFA çözüm yapmak için, 1X PBS içinde% 16 solüsyonu ile başlar ve 1X PBS 1:4 sulandırmak.)
4. Steril PBS kullanarak, yavaşça 4 ° C de PBS O / N hücreleri 3 kez yıkama ve inkübe
5. Hücreler steril PBS ile 3 kez yıkayın, daha sonra PBS ekleyin ve 4 bırakın ° C kadar ihtiyaç duyulan (maksimum saklama süresi ifade protein bağlı olarak değişebilir. Biz gözlenen etkileri önemli değişiklikler olmadan 2 hafta için neuroligin izoformlar ifade etmek için transfekte HEK293 hücreleri saklamak insülin salınımı üzerinde).

3. HEK293 Hücreler ile INS-1 Beta Hücreleri Co-kültür

1. (Glikoz ve fenol kırmızı ve glutamin olmadan) 500 ml RPMI 1640 ekleyerek INS-1 ortamı hazırlayın: 50 ml FBS, 5 ml 100X Penisilin / streptomisin, 5 ml 100X L-glutamin çözeltisi, 5 ml sodyum piruvat, 500 ul amfoterisin B, 500 ul beta-merkaptoetanol (bu medi neredeyse aynıdırum tipik olarak beta-mersaptoetanol ilavesi) hariç olmak üzere birinci adacık kültürü için kullanılmıştır.
2. (Veya başka bir enzimatik olmayan hücre sökücü) Hücre-striptizci kullanarak, hasat INS-1 T75 kültürü şişesi altındaki kapalı confluency yaklaşık% 70-80 olarak hücreleri. Her şişe 48 kuyu için yaklaşık yeterli hücre sağlayacaktır.
3. INS-1 ve HEK medya bir 50/50 karışımı içinde tekrar süspansiyon 1,200 rpm'de 3 dakika boyunca santrifüj hücre aşağı iplik sonra. INS-1 hücreleri, bir% 70-80 oranında konfluent şişeye, karma ortamın yaklaşık 25 ml süspansiyon haline getirin.
4. Yerine canlı HEK293 hücreleri daha paraformaldehid giderildi HEK293 hücreleri kullanıyorsanız,% 100 yerine karışık teknik daha INS-1 medya INS-1 hücreleri tekrar süspansiyon.
5. 10 ml'lik bir pipet kullanarak, homojen bir hücre süspansiyonu için pelet hücreleri çıkarmak.
6. HEK293 hücreleri üzerinde ortamı çıkarmak için aspire.
7. Bir P1000 pipet kullanarak, yavaşça o kenarları boyunca HEK hücre tabakası üzerine INS-1 hücre süspansiyonu 500 ul ekleyinf iyi. Her 6 kuyu sonra, homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için tekrar INS-1 hücreleri tekrar süspansiyon 10 ml'lik bir pipet kullanın. Kokültürü kurulum genel şeması Şekil 1 'de tasvir edilmiştir.
8. Deneysel protokol bağlı olarak 24-48 saat boyunca inkübe hücreleri.
9. Fazla 48 saat kokültürü süresi gerekiyorsa, HEK293 hücreleri düzeltmek için bölüm yukarıdaki 2 isteğe bağlı adımları kullanın.
10. Birincil ayrışmış kemirgen ya da insan adacıklar kullanarak [örneğin vallahi ^11-15 öncesinde protokolleri görmek] ise, 5 ml kalem / strep, 5 böyle RPMI gibi uygun bir ortam ml L-Glut, 0.5 ml amfoterisin-B yerine kullanılmasını sağlamak INS-1 medya. Bir çünkü potansiyel olarak gerekli adacıklar çok sayıda uygulamada, bir 24 plaka ayrışmış adacık hücreleri kullanabilirsiniz rağmen, göz bir 48 plaka (iyi başına daha az adacık hücre gerektiren) için ölçekleme aşağı verilmesi önerilir. Bir 48 plaka üzerinde, çözülme değerinde yaklaşık 100 adacık ekleyinbaşlatmak için plaka başına ted hücreleri. Ayrışma etkinliği ve kullanılan yönteme bağlı olarak, daha az sayıda adacık gerekebilir.

4. Glikoz insülin salgılanması Uyarılmış

1. 1 saat arasında, en az KRB 2.5 mM glükoz (Krebs-Ringer bikarbonat tamponu), 250 ul hücre Preincubate. , Preincubate kokültürü orta kaldırmak ve hemen KRB ile değiştirmek için. Bu değişim ortamdaki oksijene INS-1 hücreleri etkisini en aza indirmek için, bir seferde bir tane de yapılmalıdır. Diğer düşük (2.5 mM) glukoz KRB pipetleme sırasında tek elle aspire.
2. 2.5 mM veya bir zamanda iyi KRB tamponu biri 20 mM glükoz ya da 250 ul inkübasyon öncesi değişimi KRB.
3. Belirli bir deney için uygun olduğu takdirde, örneğin 100 uM IBMX gibi ek salgı daha sağlam bir uyarılmış insülin salgılama tepkisi üretmek için ilave edilebilir. Özellikle ayrışmış birincil adacık beta hücreleri artmış glukoz konsantrasyonları Alon için kötü duyarlıE, yani IBMX veya diğer salgı burada özellikle ilave ^16,17 dikkate alınmalıdır.
4. Inkübasyondan 1 saat sonra, ortam tüpler mikrofuge'de ve 5 dakika boyunca 1500 x g'de dönmeye aktarın.
5. Süpernatant 200 ul çıkarın ve insülin RIA veya ELISA ile analiz için kullanabilirsiniz.
6. Hücre lisatı hazırlamak için, (% 1.0 IGEPALCA-630 veya Nonidet P-40,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 0.1 SDS, 50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCI), proteaz inhibitörleri için RIPA hücre parçalama tamponu 100 ul hemen 4 de medya ve inkübe kaldırarak ° C 20 dakika sonra plaka.
7. 10,000 x g 'de 15 dakika boyunca lizat Spin ve insülin RIA ve ELISA ile analiz için süpernatan 50 ul çıkarın.

Sonuçlar

Burada açıklanan yöntem kullanılarak, insülin salgılanması üzerindeki protein neuroligin farklı türevleri etkisini test ettik. Bu beta hücresi işlevi, ¹⁰ neuroligin-2 etkisini araştıran eden yayımlanmış çalışma tamamlar. Şekil 2, örneğin, burada adlandırılan bir neuroligin izoformu ifade etmek için transfekte HEK293 hücreleri ile birlikte coculturing INS-1 beta hücrelerinden elde edilen sonuçları göstermektedir NL- X Bu deney NL-X insülin salgısını artırdı...

Tartışmalar

Burada açıklanan kokültürü yöntemi özel beta-hücre yüzey, transmembran proteinlerin fizyolojik önemini belirlemek için etkili bir yol sağlar, ve özel olarak ekstrasellüler etki. Hücre yüzeyi üzerinde bir ilgi protein görüntüleme HEK293 hücreleri ile temas içinde kültürlenmesi beta hücreleri ya da insülinoma hücrelerine (örneğin, burada kullanılan INS-1 hücreleri gibi) ile, deney doğrudan zarar vermeden hücre dışı protein-protein etkileşimleri etkilerini belirlemek için dizayn edileb...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
pcDNA 3.3 vector/backbone	Invitrogen	K830001
Lipofectamine 2000	Invitrogen	18324012
DMEM	Mediatech	45001-312
Pen/strep solution	Mediatech	45001-652-1
Amphotericin B	Mediatech	45001-808-1/30
RPMI-1640	Mediatech	45001-404
D-PBS	Mediatech	45001-434
Sodium Pyruvate	Mediatech	45001-710-1
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985023
Cell stripper	Mediatech	45000-668
T75 Flask	BD	1368065
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50980487
10X PBS	Mediatech	45001-130
Fetal bovine serum	Mediatech	MT35010CV
IBMX	Sigma	I5879-100MG
RIPA lysis buffer	Sigma	R0278