膵β細胞によるインスリン分泌に影響を及ぼす細胞外タンパク質相互作用の共培養分析

要約

経細胞タンパク質相互作用は、膵臓β-細胞機能の重要な決定因子である。法適応特定貫通タンパク質がインスリン分泌にどのように影響するかを調査するためのシナプス-の共培養モデルからは、ここで詳しく説明します。トランスフェクトしたHEK293細胞は、目的のタンパク質を発現し、β細胞は、トランスフェクションまたは他の方法で直接摂動する必要はありません。

要約

細胞表面タンパク質間の相互作用は隣接セルの機能を調整するのに役立ちます。膵臓β細胞を膵島内にクラスタ化し、グルコース恒常性を維持するために調整された様式で作用している。これは、隣接したβ細胞表面の膜貫通タンパク質間の相互作用は、β細胞機能の重要な決定要因であることがますます明らかになりつつある。

培養β細胞またはin vivoでノックダウン、ノックアウトまたは過剰発現の研究により、特定の経細胞相互作用の役割の解明は、潜在的影響の分析を混乱させることができる方法でβ-細胞の健康及び/又は機能に影響を与え、mRNAおよびタンパク質の発現の直接的な摂動を必要とする具体的な相互作用の。これらはまた、標的蛋白質の細胞内ドメインのレベルを変更し、DISであることが同じ細胞膜内のタンパク質間の相互作用による影響を防ぐことが近づく経細胞の相互作用の影響からtinguished。

ここでβ細胞のインスリン分泌能力と応答上の特定の経細胞相互作用の効果を決定するための方法が提示される。この方法は、例えば、INS-1細胞などのベータ細胞株、および解離プライマリβ細胞にも適用可能である。それはシナプス形成を駆動するための重要なタンパク質を同定したHEK293（またはCOS）細胞層に発現して、特定の神経細胞のタンパク質への培養神経細胞のその露出を発見した神経生物学者が開発した共培養モデルに基づいています。神経シナプスのとβ細胞の分泌機構との間に類似点を考えると、我々はβ細胞機能の成熟は、同様の経細胞の相互作用によって駆動されるかもしれないと考えた。我々は、β細胞は、目的のタンパク質を発現するHEK293細胞層上で培養されたシステムを開発した。このモデルでは、β-細胞の細胞質は、細胞外タンパク質interactioながらそのままですNSは、操作されます。我々は、主にグルコース刺激性インスリン分泌の研究に焦点を当てているが、ここで、他のプロセスを解析することができ、例えば、遺伝子発現の変化は、免疫ブロット法または定量PCRによって決定される。

概要

ここでは、特定の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、インスリン分泌をどのように影響するかの調査を容易にする方法が記載されている。膵臓β-細胞表面上のタンパク質（あるいは他の分子）と目的のタンパク質との相互作用の影響方法プローブ。この方法は、ベータ細胞または他の隣接セル（ 例えば、内皮細胞、神経細胞、膵臓α細胞）によって発現細胞表面タンパク質は、細胞間の相互作用（ すなわち、隣接する表面上の相互作用パートナーとの相互作用を介し介しβ細胞機能にどのように影響するかの調査を可能にするβ細胞）。

細胞の形質膜は、細胞外環境へのブリッジとしての構造的および機能的タンパク質の複雑な配列が含まれています。経接続の形成によりまたはプラスチックシグナル伝達事象を開始することにより、細胞表面タンパク質間の相互作用は、コーディネートすることができ隣接セルの機能を有する。膵臓β細胞を膵島内にクラスタ化し、グルコース恒常性^を維持するために^、1協調して作用している。細胞外EPHA-ephrinAおよびグルコース刺激性インスリン分泌の調節におけるニューロリギン-2相互作用の重要性によって、例えば、明らかにし、それがますます明らかになってきている隣接表面にタンパク質との間に発生する相互作用の増大した細胞外知識ベータ細胞がインスリン分泌、β細胞機能の成熟と^1-3グルコース恒常性の維持の完全な理解を得るための非常に重要になります。ここに記載された方法の目的は、特定の膜貫通または他の細胞表面結合タンパク質を含む経細胞相互作用のβ細胞機能への影響の調査を可能にすることである。異なる発現構築物でトランスフェクトしたHEK293細胞との共培養β細胞、Bの効果によって異なる細胞表面タンパク質または変異した変異体のイータ細胞機能としては、効率的に探査することができる。これは、β細胞自体をトランスフェクトすることなく達成される。

培養β細胞またはin vivoでノックダウン、ノックアウトまたは過剰発現の研究により、特定の経細胞相互作用の役割の解明は、潜在的の分析を混乱させることができる方法でβ細胞の健康及び/又は機能に影響を与え、β-細胞のmRNAおよびタンパク質の発現の直接的な摂動を必要とする特定の細胞外相互作用の効果。これらはまた、標的蛋白質の細胞内ドメインのレベルを変更し、さらに、経細胞間相互作用の影響を区別する上で、同じ細胞内のタンパク質間の相互作用による影響を許可しない近づく。ここでは、β細胞のインスリン分泌能力と応答上の特定の経細胞相互作用の効果を決定するための方法は、descrをあるアイベッド。この方法は、例えば、INS-1細胞⁴とインスリン分泌β-細胞株、および解離プライマリげっ歯類またはヒトβ細胞にも適用可能である。なお、HEK293（またはCOS）細胞層に発現して、特定の神経細胞のタンパク質に培養ニューロンの露出がドライブシナプス形成^5,6というタンパク質を同定することができるが見つかりました神経生物学者、によって開発された共培養モデルに基づいています。神経シナプスのとβ細胞の分泌機構との間に類似点を考えると、我々は、β細胞機能を推論し、機能的成熟は、同様の経細胞の相互作用^7-9によって駆動されることがあります。これらの相互作用を調査するために、我々は、β細胞が関心¹⁰のタンパク質を発現するHEK293細胞の層上に共培養された本明細書に記載のシステムを開発した。このシステムは、細胞外タンパク質 - タンパク質相互作用を操作しながらベータ細胞質をそのまま維持することができる。

プロトコル

1。 HEK293レイヤーのトランスフェクション

1. DMEM 500mlのボトル（4.5グラム/ mlのグルコースとフェノールレッドとし、グルタミンなし）に追加することによりHEK293細胞培地を準備：50ミリリットルFBS、5ミリリットル100Xペニシリン/ストレプトマイシン溶液、5ml 100倍のL-グルタミン溶液と500μlのアムホテリシンをB.
2. ウェル当たりHEK293 0.5mlのメディアを用いて24ウェルプレートでHEK293細胞外板。細胞がプレートの底に均等に分散されていることを確認。
3. ときHEK293細胞は、プラスミドの0.8μgのは、目的のタンパク質（哺乳動物発現ベクターに挿入）とリポフェクタミンプロトコールに従ってリポフェクタミン2000年2μlのコーディングとトランスフェ密集度100％に達する。我々は、哺乳動物細胞での発現のために設計されたpcDNA 3.3バックボーンを使用することを選択した。
4. オプションとして、インキュベーションの6時間後、正常HEK293メディアとリポフェクタミンプロトコールに記載のトランスフェクションのメディアを交換します。
5. トランスフェproteの発現を評価するために、に、トランスフェクトされた組織培養ウェルのサブセットは、発現タンパク質の免疫検出のために、または標準的な技術を用いてタンパク質発現のウェスタンブロット分析のために使用することができる。

2。 HEK293細胞の任意の固定はトランスフェタンパク質を発現

トランスフェクトしたHEK293細胞を穏やかに（また、ディスカッションを参照）HEK293細胞（ 例えば下記ステップ3.9）生きているか、またはすべてを一度にいくつかの実験のためのプレートの前に効率的な準備を可能にするために有害かもしれないメディアで共培養を容易にするために固定することができる。

1. HEK293細胞におけるタンパク質の発現の経時変化を決定するために、パイロット研究を行う。
2. HEK293細胞層をトランスフェクションした後、発現の最高レベルに関連付けられているトランスフェクション後の時点で細胞から培地を吸引除去。これが最初の24時間以内に発生した場合、トランスフェクション後24時間までは吸引しないでください。
3. HEを洗うD-PBSで軽くK293細胞は、次いで、500μlの4％パラホルムアルデヒド（PFA）を加え、室温で30分間インキュベートする。 （4％PFAのソリューションを作成するには、1×PBSで16％溶液を用いて開始し、1X PBSで1:4希釈してください。）
4. 滅菌PBSを使用して、静かに4℃でPBS O / Nで細胞を3回とインキュベートを洗う
5. 細胞を滅菌PBSで3回洗浄し、PBSを追加し、4のまま°Cを必要になるまで（最大記憶時間が発現されたタンパク質によって異なる場合があります私たちは、観察された効果を大幅に変更することなく、2週間までのニューロリギンアイソフォームを発現するようにトランスフェクトしたHEK293細胞を保存するインスリン分泌に）。

3。 HEK293細胞を用いたINS-1ベータ細胞の共培養

1. 50ミリリットルFBS、5ミリリットル100Xペニシリン/ストレプトマイシン、5ミリリットル100X L-グルタミン溶液、5mlのピルビン酸ナトリウム、500μlのアンホテリシン：500ミリリットルRPMI 1640（グルコースおよびフェノール赤とグルタミンなし）に追加することにより、INS-1メディアの準備B、​​500μlのβ-メルカプトエタノール（これはメディとほぼ同じですええと、通常のβ-メルカプトエタノールの添加）を除いて主要な膵島培養に用いる。
2. 収穫T75培養フラスコの底から約70〜80％コンフルエントでINS-1細胞、細胞ストリッパー（または別の非酵素的細胞の除去）を使用。各フラスコには、48の井戸のためにおよそ十分な細胞を提供する。
3. INS-1およびHEKメディアの50/50ミックスで再懸1,200 rpmで3分間、遠心で細胞をスピンダウンした後。 INS-1細胞の70〜80％コンフルエントなフラスコは、ミクストメディア約25mlに懸濁します。
4. むしろ生きたHEK293細胞よりもホルムアルデヒドで固定されたHEK293細胞を用いた場合、100％ではなく、混合メディアよりINS-1のメディアでINS-1細胞を再懸濁します。
5. を10mlのピペットを用いて、均質な細胞懸濁液を作るためにペレットから細胞を取り除く。
6. HEK293細胞にメディアを取り出すように吸引。
7. P1000のピペットを用いて、穏やかoが側面に沿ってHEK細胞層上にINS-1細胞懸濁液500μLを加えるfをよく。毎年6井戸の後、均質細胞懸濁液を確保するために、再びINS-1細胞を再懸濁し、10ミリリットルピペットを使用しています。共培養のセットアップの全体的なスキームを図1に示されている。
8. 実験プロトコルに応じて24〜48時間、細胞をインキュベート。
9. 以上48時間共培養期間が必要な場合は、HEK293細胞を固定するために、上記のセクション2のオプションのステップを使用しています。
10. プライマリー解離げっ歯類やヒト膵島 ​​を使用している場合は、5ミリリットルペン/連鎖球菌、5ミリリットルL-供給過剰となRPMIとしてその適切なメディアを確実に0.5ミリリットルアンホテリシン-Bの代わりに使用されている[ 例えば、Joveの^11-15で前のプロトコルを参照してください。] INS-1メディア。 1が原因で潜在的に必要とされる島の多数の実施においては、24ウェルプレートに解離膵島細胞を使用することができますが、それは配慮​​が48ウェルプレート（ウェルあたり少ない膵島細胞を必要とする）にスケーリングまで与えられることをお勧めします。 48ウェルプレートに、解離の価値は約100の小島を追加開始するためのプレート当たりテッド細胞。解離の効果、使用方法に応じて、より少ない膵島が必要とされてもよい。

4。グルコース刺激インスリン分泌

1. 1時間の最低KRBで2.5 mMグルコース（クレブス - リンゲル重炭酸塩緩衝液）250μlの中の細胞をPreinc​​ubate。 、preinc​​ubate共存培地を除去し、直ちにKRBと交換する。この交換は、環境酸素にINS-1細胞の曝露を最小限にするために一度に1つのウェルを行う必要があります。お互いに低い（2.5 mM）をグルコースKRBピペッティングしながら片手で吸引。
2. 2.5mMのか一度よくKRBバッファー1で20 mMグルコースどちら250μlのに為替プレインキュベーションKRB。
3. 具体的な実験のために適切であれば、例えば100μMのIBMXなどの追加分泌は、より堅牢な刺激性インスリン分泌応答を生成するために添加してもよい。具体的には解離した一次膵島β細胞が増加したグルコース濃度のALONに乏しい応答するeはので、ここでIBMXまたは他の分泌促進物質の添加は、特に^16,17考慮すべきである。
4. インキュベーションの1時間後、メディアはチューブを微量、5分間1500×gでのスピンに移す。
5. 上清200μlのを削除し、インスリンRIAやELISAによる分析のためにこれを使用しています。
6. 細胞溶解物を調製するには、プロテアーゼ阻害剤とのRIPAの細胞溶解緩衝液（150mMのNaCl、1.0％IGEPALCA-630またはノニデットP-40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS、50mMトリス、pH8.0）を100μlのを追加すぐに4でメディアとインキュベートを除去した後プレート℃で20分間。
7. 10,000 xgで15分間ライセートをスピンダウンし、インスリンRIAやELISAによる分析のために上清50μlのを削除します。

結果

メソッドを使用してここで説明する、私たちは、インスリン分泌にプロテインニューロリギンの異なる亜種の効果をテストしました。これは、β細胞機能¹⁰上ニューロリギン-2の効果を調査我々の公開されて仕事を補完する。 図2は、例えば、ここで呼ばれるニューロリギンアイソフォームを発現するようトランスフェクトHEK293細胞と共培養するINS-1ベータ細胞から得られ?...

ディスカッション

共培養方法は、β-細胞表面の特異的膜貫通タンパク質の、特にその細胞外ドメインの生理学的重要性を決定するために効果的な方法を提供ここで説明する。細胞表面上の関心のあるタンパク質を表示するHEK293細胞と接触で培養β細胞又はインスリノーマ細胞（例えば、ここで用いINS-1細胞など）により、実験を直接妨げることなく、細胞外タンパク質 - タンパク質相互作用の効果を決定するよ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
pcDNA 3.3 vector/backbone	Invitrogen	K830001
Lipofectamine 2000	Invitrogen	18324012
DMEM	Mediatech	45001-312
Pen/strep solution	Mediatech	45001-652-1
Amphotericin B	Mediatech	45001-808-1/30
RPMI-1640	Mediatech	45001-404
D-PBS	Mediatech	45001-434
Sodium Pyruvate	Mediatech	45001-710-1
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985023
Cell stripper	Mediatech	45000-668
T75 Flask	BD	1368065
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50980487
10X PBS	Mediatech	45001-130
Fetal bovine serum	Mediatech	MT35010CV
IBMX	Sigma	I5879-100MG
RIPA lysis buffer	Sigma	R0278