Análise de co-cultura da Relação de proteínas extracelulares que afetam secreção de insulina por células beta pancreáticas se

Resumo

Interações de proteínas intracelulares são determinantes importantes da função das células beta no pâncreas. Detalhado aqui é um método adaptado a partir de um modelo de co-cultura de synaptogenesis-para investigar como as proteínas transmembrana específicos influenciar a secreção de insulina. As células HEK293 transfectadas expressam as proteínas de interesse, células beta não precisa ser transfectadas directamente ou de outro modo perturbado.

Resumo

Interações entre proteínas de superfície celular ajudar a coordenar a função das células vizinhas. Células beta do pâncreas são agrupados dentro de ilhotas pancreáticas e agir de forma coordenada para manter a homeostase da glicose. Está se tornando cada vez mais claro que as interações entre proteínas transmembrana nas superfícies de células beta adjacentes são importantes determinantes da função das células beta.

Elucidação dos papéis particulares interações transcelulares por estudos knockdown, nocaute ou superexpressão em células beta cultura ou in vivo necessita de perturbação direta de mRNA e expressão da proteína, potencialmente afetando a saúde das células beta e / ou função de maneiras que poderiam confundir análises dos efeitos de interacções específicas. Estas abordagens também alterar os níveis dos domínios intracelulares das proteínas alvo e podem evitar os efeitos devido às interacções entre as proteínas no interior da mesma membrana da célula para ser disdiferenciadas das efeitos das interacções transcelulares.

Aqui, um método para a determinação do efeito de interacções específicas transcelular na capacidade de segregar insulina e capacidade de resposta das células beta é apresentado. Este método aplica-se a linhas de células-beta, tais como células INS-1, e para as células beta primárias dissociadas. Baseia-se em modelos de co-cultura desenvolvidas por neurobiólogos, que descobriu que a exposição de neurônios cultivados às proteínas neuronais específicos expressos em HEK293 (ou COS) camadas de células identificadas proteínas importantes para a condução de formação de sinapses. Dadas as semelhanças entre a maquinaria de secreção das sinapses neuronais e das células beta, que argumentou que a maturação funcional das células beta pode ser conduzido por interações transcelulares semelhantes. Foi desenvolvido um sistema em que as células beta são cultivadas sobre uma camada de células HEK293 expressando uma proteína de interesse. Neste modelo, o citoplasma da célula beta é tocada enquanto extracelular da proteína-proteína interactions são manipulados. Embora o foco aqui primariamente em estudos de glicose estimulada a secreção de insulina, outros processos podem ser analisados, por exemplo, as alterações na expressão do gene, como determinado por imunotransf erência ou qPCR.

Introdução

Descrevemos aqui um método para facilitar as investigações de como os domínios extracelulares de proteínas transmembrana específicos afetam a secreção de insulina. O método sondas os efeitos das interacções da proteína de interesse com proteínas (ou possivelmente de outras moléculas), na superfície das células beta do pâncreas. O método permite investigações de como as proteínas da superfície celular, expressas por células beta ou por outras células vizinhas (por exemplo, células endoteliais, neurónios, células alfa pancreáticas) afectam a função das células beta através de interacções transcelulares (isto é, através de interacções com os parceiros de interacção na superfície adjacente células beta).

A membrana plasmática celular contém um conjunto complexo de proteínas estruturais e funcionais, que servem como ponte para o ambiente extracelular. Pela formação de ligações transcelular ou por abertura de eventos de sinalização de plástico, as interações entre proteínas de superfície celular pode ajudar a coordenar afunção das células vizinhas. Células beta do pâncreas são agrupados dentro das ilhotas pancreáticas e agir de forma coordenada para manter a homeostase da glicose ^1. Como revelado, por exemplo, a importância da extracelular EPHA-ephrinA e neuroligin-2 interações na regulação da glicose estimulada a secreção de insulina, está se tornando cada vez mais claro que o aumento do conhecimento das interações entre proteínas extracelulares que ocorrem nas superfícies das adjacente células beta será de grande importância para a obtenção de uma compreensão completa da secreção de insulina, a maturação funcional das células beta e na manutenção da homeostase da glicose ^1-3. O objectivo do método descrito aqui é o de permitir investigações dos efeitos sobre a função de interacções envolvendo transcelular transmembranar específica ou de outro modo, as proteínas de superfície celular associados à célula beta. Por células beta co-cultura com células HEK293 transfectadas com diferentes construções de expressão, os efeitos sobre a bfunção das proteínas da superfície das células diferentes ou variantes mutadas célula eta do mesmo pode ser eficientemente sondadas. Isto é conseguido sem a necessidade de transfectar as próprias células beta.

Elucidação dos papéis particulares interações transcelulares por estudos knockdown, nocaute ou superexpressão em células beta cultura ou in vivo necessita de perturbação direta de mRNA das células beta e expressão da proteína, potencialmente afetando a saúde das células beta e / ou função de maneiras que poderiam confundir análise de os efeitos das interacções extracelulares específicos. Estas abordagens também alterar os níveis dos domínios intracelulares das proteínas alvo e, além disso, não permitem que os efeitos devido às interacções entre as proteínas sobre ou dentro da mesma célula para se distinguir os efeitos de interacção intracelular. Aqui, um método para determinar o efeito das interacções específicas transcelular na capacidade de segregar insulina e capacidade de resposta das células beta é described. Este método aplica-se a linhas de células beta secretoras de insulina, tais como as células INS-1, ⁴ e roedor primárias dissociadas ou células beta humanas. Baseia-se em modelos de co-cultura desenvolvidos por neurobiologists, que verificaram que a exposição de culturas de neurónios a proteínas neuronais específicos expressos em HEK293 (COS), as camadas de células conseguiu identificar as proteínas que conduzem a formação de sinapses ^5,6. Dadas as semelhanças entre a maquinaria de secreção das sinapses neuronais e das células beta, que argumentou que a função das células beta e maturação funcional pode ser conduzido por interações transcelulares semelhantes ^7-9. A fim de investigar estas interacções, foi desenvolvido o sistema aqui descrito, em que as células beta são co-cultivadas numa camada de células HEK293 expressando uma proteína de interesse ^10. Este sistema permite que o citoplasma das células beta para permanecer intacta enquanto extracelulares interacções proteína-proteína são manipulados.

Protocolo

1. A transfecção de HEK293 Camada

1. Prepara HEK293 meio celular por adição a 500 ml de frascos de meio DMEM (com 4,5 g / ml de glucose e de vermelho de fenol e sem glutamina): 50 ml de FBS, 5 mL de 100X solução de estreptomicina penicilina /, 5 ml de solução de L-glutamina e 500 100x anfotericina ul B.
2. Placa para células HEK293 em uma placa de 24 poços utilizando 0,5 ml de meio por poço HEK293. Assegure-se que as células são distribuídos uniformemente em toda a parte inferior da placa.
3. Quando as células HEK293 chegar a 100% de confluência, transfecção com 0,8 ug do plasmídeo que codifica a proteína de interesse (inserido num vector de expressão de mamífero) e 2 ul de Lipofectamina 2000, de acordo com o protocolo de lipofectamina. Optou-se por utilizar o pcDNA 3,3 backbone projetado para expressão em células de mamíferos.
4. Opcionalmente, após 6 horas de incubação, a troca da mídia transfecção descrito no protocolo Lipofectamine com HEK293 meios normais.
5. Para avaliar a expressão da prote transfectadasnum subconjunto dos poços de cultura de tecidos transfectados podem ser usadas para a detecção de imunofluorescência da proteína expressa ou para análise por Western blot da expressão da proteína, utilizando técnicas convencionais.

2. A fixação opcional de células HEK293 que expressam a proteína Transfectadas

As células HEK293 transfectadas podem ser fixados suavemente, a fim de facilitar a co-cultura em meios que podem ser prejudiciais para a vida (por exemplo, células HEK293 passo 3.9 abaixo), ou para permitir que a preparação eficiente de antecedência de placas para várias experiências de uma só vez (ver também a discussão).

1. Realizar estudos piloto para determinar a evolução no tempo da expressão da proteína nas células HEK293.
2. Após transfecção de células da camada HEK293, aspirar os meios de comunicação das células no ponto de tempo pós-transfecção associado com maior nível de expressão. Se isto ocorre dentro das primeiras 24 horas, não se aspirar até 24 horas após a transfecção.
3. Lave HEK293 células suavemente com D-PBS, em seguida adicionar 500 mL de 4% de paraformaldeído (PFA) e incubar a temperatura ambiente durante 30 min. (Para fazer a solução de PFA 4%, comece com uma solução de 16% em 1X PBS e diluir 1:04 com 1X PBS).
4. Utilizando PBS estéril, lavar suavemente as células três vezes em PBS e incubar O / N a 4 ° C.
5. Lavar as células 3 vezes com PBS estéril, em seguida, adicionar PBS e deixar a 4 ° C até ser necessário (tempo máximo de armazenamento poderá variar dependendo da proteína expressa. Nós armazenar células HEK293 transfectadas para expressar neuroligina isoformas de até 2 semanas, sem alterações significativas nos efeitos observados sobre a secreção de insulina).

3. Co-cultura de INS-1 beta células com células HEK293

1. Prepara INS-1 media adicionando a 500 ml de meio RPMI 1640 (com glicose e de vermelho de fenol e sem glutamina): 50 ml de FBS, 5 mL de 100X de penicilina / estreptomicina, 5 ml de solução de L-glutamina 100X, 5 mL de piruvato de sódio, 500 mL de anfotericina B, 500 ul de beta-mercaptoetanol (isto é quase idêntico ao do medihum normalmente usado para a cultura ilhéu principal, exceto para a adição de beta-mercaptoetanol).
2. Utilizando-celular de remoção (ou outro removedor de células não enzimática), INS-1 de colheita de células de aproximadamente 70-80% de confluência fora da parte inferior de um frasco de cultura T75. Cada frasco de células irá fornecer aproximadamente suficiente para 48 poços.
3. Depois girando as células na centrífuga durante 3 min a 1200 rpm, ressuspender em uma mistura 50/50 de INS-1 e meios de HEK. Para um frasco confluente de 70-80% de células INS-1, ressuspender em cerca de 25 ml de meios mistos.
4. Se estiver usando células HEK293 que foram fixados em paraformaldeído, em vez de células vivas HEK293, ressuspender as células INS-1 em 100% INS-1 media, em vez de mídia mista.
5. Utilizando uma pipeta de 10 ml, desalojar as células da pelota para fazer uma suspensão de células homogéneas.
6. Aspirar para remover os meios de comunicação sobre as células HEK293.
7. Usando uma pipeta P1000, adicionar cuidadosamente 500 ul de suspensão de célula INS-1 sobre a camada de células HEK ao longo dos lados of poço. Após cada 6 poços, usar uma pipeta de 10 ml para ressuspender as células INS-1 de novo para assegurar uma suspensão homogénea de células. O esquema geral da co-cultura set-up é mostrado na Figura 1.
8. Incubar as células durante 24-48 horas, dependendo do protocolo experimental.
9. Se for necessário mais de 48 período de co-cultura hr, use passos opcionais na seção 2 acima para corrigir as células HEK293.
10. Se estiver usando o roedor dissociada primária ou ilhotas humanas [eg ver protocolos anteriores em Jove ^11-15], certifique-se de que uma mídia adequados, como RPMI com 5 ml pen / strep, 5 ml L-Glut, 0,5 ml anfotericina-B é usado em vez de media uma INS-. Embora se possa utilizar as células das ilhotas dissociadas numa placa de 24 poços, na prática, devido ao grande número de ilhotas potencialmente necessários, é recomendado que seja tida em consideração a redução de escala para uma placa com cavidades 48 (necessitando de menos células de ilhéus por poço). Em uma placa de 48, adicionar cerca de 100 ilhotas no valor de dissociaçãoted células por placa para começar. Dependendo da eficácia de dissociação e do método utilizado, menor número de ilhotas pode ser necessária.

4. Glicose estimulada secreção de insulina

1. Pré-incubação de células em 250 uL de 2,5 mM de glucose em KRB (tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer) durante um mínimo de 1 hora. Para pré-incubar, remova o meio de co-cultura e substituir imediatamente com KRB. Esta troca deve ser feito um poço de cada vez para minimizar a exposição de células INS-1 para oxigênio ambiental. Aspirar com uma mão enquanto a pipetagem baixa (2,5 mM) de KRB de glicose com a outra.
2. Taxas de pré-incubação de KRB a 250 ul de ambos 2,5 mM ou 20 mM de glucose em um tampão KRB assim de cada vez.
3. Se for apropriado para o ensaio específico, secretagogos adicionais, tais como 100 ^ M de IBMX pode ser adicionado para produzir uma resposta mais forte de secreção de insulina estimulada. Células beta das ilhotas principais dissociadas em particular, são pouco responsiva ao aumento da concentração de glicose alone, portanto, aqui especialmente a adição de IBMX ou outros secretagogos deve ser considerada ^16,17.
4. Após 1 hora de incubação, transferir mídia para microcentrifugue tubos e girar 1.500 xg por 5 min.
5. Remover 200 ul do sobrenadante e utilizar este para a análise da insulina por RIA ou ELISA.
6. Para se preparar o ligado celular, adicionar 100 ul de tampão de lise celular RIPA (NaCl 150 mM, 1,0% IGEPALCA-630 ou Nonidet P-40, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, Tris a 50 mM, pH 8,0) com inibidores de protease para o placa imediatamente após a remoção de meios de comunicação e incubar a 4 ° C durante 20 min.
7. Girar lisado durante 15 minutos a 10000 xg e retirar 50 ul de sobrenadante para a análise da insulina por RIA ou ELISA.

Resultados

Utilizando o método descrito aqui, testámos o efeito de diferentes variantes do neuroliguinas proteína na secreção de insulina. Isto complementa a obra publicada a investigar o efeito da neuroliguinas-2 em função das células beta ^10. Figura 2, por exemplo, descreve os resultados obtidos a partir coculturing INS-1 células beta com células HEK293 transfectadas para expressar uma isoforma neuroliguinas referido aqui como NL- X. Esta experiência foi concebida para testar a hipótese de...

Discussão

O método de co-cultura aqui descrito fornece um meio eficaz para determinar a importância fisiológica das proteínas beta da superfície da célula, transmembranares específicos, e, especificamente, dos seus domínios extracelulares. Por cultura de células beta (ou células de insulinoma, tais como as células INS-1 utilizados aqui), em contacto com células HEK293 que indica uma proteína de interesse sobre a superfície celular, as experiências podem ser concebidas para determinar os efeitos da extracelulares in...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
pcDNA 3.3 vector/backbone	Invitrogen	K830001
Lipofectamine 2000	Invitrogen	18324012
DMEM	Mediatech	45001-312
Pen/strep solution	Mediatech	45001-652-1
Amphotericin B	Mediatech	45001-808-1/30
RPMI-1640	Mediatech	45001-404
D-PBS	Mediatech	45001-434
Sodium Pyruvate	Mediatech	45001-710-1
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985023
Cell stripper	Mediatech	45000-668
T75 Flask	BD	1368065
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50980487
10X PBS	Mediatech	45001-130
Fetal bovine serum	Mediatech	MT35010CV
IBMX	Sigma	I5879-100MG
RIPA lysis buffer	Sigma	R0278