Analisi co-coltura delle interazioni proteina extracellulare che influenzano secrezione di insulina da parte del pancreas cellule beta

Riepilogo

Proteina transcellulare sono importanti determinanti della funzione delle cellule beta del pancreas. Dettagliata qui è un metodo adattato da un modello di co-coltura di sinaptogenesi, per indagare come proteine ​​transmembrana specifici influenzano la secrezione di insulina. Trasfettate HEK293 cellule esprimono proteine ​​di interesse; cellule beta non hanno bisogno di essere trasfettate o meno perturbato direttamente.

Abstract

Le interazioni tra le proteine ​​di superficie cellulare aiutano a coordinare la funzione delle cellule vicine. Cellule beta del pancreas sono raggruppati insieme all'interno di isole pancreatiche e di agire in modo coordinato per mantenere l'omeostasi del glucosio. E 'sempre più evidente che le interazioni tra proteine ​​transmembrana sulla superficie delle cellule beta adiacenti sono importanti determinanti della funzione beta-cellulare.

Chiarimento dei ruoli di particolari interazioni transcellulare di atterramento, knockout o sovraespressione studi in beta cellule in coltura o in vivo richiede perturbazione diretta di mRNA e l'espressione della proteina, con potenziali ripercussioni di salute delle cellule beta e / o la funzione in modi che potrebbero confondere analisi degli effetti di interazioni specifiche. Questi approcci alterano anche i livelli dei domini intracellulari delle proteine ​​mirate e può prevenire effetti dovuti a interazioni tra proteine ​​all'interno della stessa membrana cellulare per essere distinguished dagli effetti di interazioni transcellulare.

Qui viene presentato un metodo per determinare l'effetto di specifiche interazioni transcellulare sulla capacità secernere insulina e la reattività delle cellule beta. Questo metodo è applicabile alle linee di beta-cellule, come cellule INS-1, e di dissociate beta cellule primarie. Si basa su modelli di co-coltura sviluppate da neurobiologi, che hanno trovato che l'esposizione di neuroni coltivati ​​a specifiche proteine ​​neuronali espresse in HEK293 (o COS) strati di cellule identificate proteine ​​importanti per la guida di formazione delle sinapsi. Date le analogie tra la macchina secretoria delle sinapsi neuronali e di cellule beta, abbiamo concluso che la maturazione funzionale delle cellule beta potrebbe essere guidato da interazioni simili transcellulare. Abbiamo sviluppato un sistema in cui le cellule beta sono coltivate su uno strato di cellule HEK293 che esprimono una proteina di interesse. In questo modello, il citoplasma delle cellule beta è toccato mentre extracellulare interactio proteina-proteinans sono manipolati. Anche se ci concentriamo qui principalmente su studi di glucosio-stimolata la secrezione di insulina, altri processi possono essere analizzati, ad esempio, i cambiamenti nell'espressione genica come determinate da immunoblotting o qPCR.

Introduzione

Descriviamo qui un metodo per facilitare le indagini di come i domini extracellulari di proteine ​​transmembrana specifici influenzano la secrezione di insulina. Le sonde metodo effetti delle interazioni della proteina di interesse con proteine ​​(o eventualmente altre molecole) sulla superficie delle cellule beta pancreatiche. Il metodo permette ricerche di come le proteine ​​di superficie cellulare espressi dalle cellule beta o da altre cellule vicine (ad esempio cellule endoteliali, neuroni, cellule pancreatiche alfa) che interessano la funzione beta-cellulare attraverso interazioni transcellulare (cioè attraverso le interazioni con partner di interazione sulla superficie adiacente cellule beta).

La membrana plasmatica cellulare contiene una serie complessa di proteine ​​strutturali e funzionali che servono come ponti verso l'ambiente extracellulare. Con la formazione di connessioni transcellulare o inizio di eventi di segnalazione in plastica, le interazioni tra le proteine ​​della superficie cellulare può aiutare a coordinare lafunzione delle celle vicine. Cellule beta del pancreas sono raggruppati insieme all'interno delle isole pancreatiche e di agire in modo coordinato per mantenere l'omeostasi del glucosio ^1. Come ha rivelato, ad esempio, dalla importanza di extracellulare EPHA-ephrinA e neuroligin-2 interazioni nella regolazione del glucosio-stimolata la secrezione di insulina, sta diventando sempre più chiaro che una maggiore conoscenza delle interazioni tra le proteine ​​extracellulari che si verificano sulle superfici delle adiacenti cellule beta sarà di grande importanza per ottenere una piena comprensione della secrezione di insulina, la maturazione funzionale delle cellule beta e il mantenimento dell'omeostasi del glucosio ^1-3. L'obiettivo del metodo qui descritto è quello di consentire le indagini sugli effetti sulla funzione delle cellule beta delle interazioni che coinvolgono transcellulare transmembrana specifico o proteine ​​altrimenti-cellula-superficie-associate. Dalla co-coltura con cellule beta cellule HEK293 transfettate con diversi costrutti di espressione, gli effetti sul bla funzione delle cellule eta di diverse proteine ​​di superficie cellulare o varianti mutate della stessa può essere efficacemente controllata. Questo si ottiene senza dover transfezione delle cellule beta stessi.

Chiarimento dei ruoli di particolari interazioni transcellulare di atterramento, knockout o sovraespressione studi in beta cellule in coltura o in vivo richiede perturbazione diretta di mRNA delle cellule beta e l'espressione della proteina, potenzialmente influenzare la salute delle cellule beta e / o la funzione in modi che potrebbero confondere le analisi di gli effetti di specifiche interazioni extracellulari. Questi approcci anche alterare i livelli dei domini intracellulari delle proteine ​​mirate e, inoltre, non consentono effetti dovuti alle interazioni tra proteine ​​sulla o nella stessa cella devono essere distinti dagli effetti di interazioni transcellulare. Qui, un metodo per determinare l'effetto di specifiche interazioni transcellulare sulla capacità di secernere insulina e la reattività delle cellule beta è described. Questo metodo è applicabile alle linee di beta-cellule che secernono insulina, come cellule INS-1 ^{a 4,} e di roditori primaria dissociato o cellule beta umane. Si basa su modelli di co-coltura sviluppate da neurobiologi, che hanno trovato che l'esposizione di colture di neuroni a specifiche proteine ​​neuronali espresse in HEK293 (o COS) strati di cellule potrebbe identificare le proteine ​​che guidano la formazione delle sinapsi ^5,6. Date le analogie tra la macchina secretoria delle sinapsi neuronali e di cellule beta, abbiamo concluso che la funzione beta-cellulare e la maturazione funzionale potrebbero essere guidati da simili interazioni transcellulare ^7-9. Al fine di sondare queste interazioni, abbiamo sviluppato il sistema qui descritto in cui le cellule beta sono messi in coltura su uno strato di cellule HEK293 che esprimono una proteina di interesse ^10. Questo sistema permette al citoplasma delle cellule beta di rimanere intatto, mentre le interazioni proteina-proteina extracellulare sono manipolati.

Protocollo

1. Trasfezione di HEK293 Strato

1. Preparare HEK293 medie cella aggiungendo per bottiglie da 500 ml di DMEM (con 4,5 g / ml di glucosio e di rosso fenolo e senza glutammina): 50 ml di FBS, 5 ml 100X penicillina / streptomicina soluzione, 5 ml di soluzione di L-glutammina 100x e 500 microlitri amfotericina B.
2. Piastra su cellule HEK293 in una piastra a 24 pozzetti utilizzando 0,5 ml di HEK293 supporti per pozzetto. Assicurarsi che le cellule sono distribuite in modo uniforme in tutta la parte inferiore della piastra.
3. Quando le cellule HEK293 raggiungere il 100% di confluenza, trasfezione con 0,8 pg di plasmide codificante la proteina di interesse (inserito in un vettore di espressione di mammifero) e 2 ml di Lipofectamine 2000 secondo il protocollo Lipofectamine. Noi abbiamo scelto di utilizzare il pcDNA 3.3 backbone progettato per l'espressione in cellule di mammifero.
4. Opzionalmente, dopo 6 ore di incubazione, i mezzi di scambio di trasfezione descritto nel protocollo Lipofectamine con normali HEK293 media.
5. Per valutare l'espressione della prote transfettatein, un sottoinsieme dei pozzetti di coltura tissutale trasfettate può essere utilizzato per il rilevamento immunofluorescenza della proteina espressa o per l'analisi western blot dell'espressione della proteina usando tecniche standard.

2. Fissazione opzionale di HEK293 cellule che esprimono proteine ​​transfettati

Cellule HEK293 trasfettate possono essere fissati delicatamente per facilitare coculture in mezzi che potrebbero essere nocivi per vivere cellule HEK293 (es. passo 3.9 di seguito) o per consentire l'efficiente preparazione in anticipo di piastre per diversi esperimenti tutti in una volta (vedi anche la discussione).

1. Condurre studi pilota per determinare l'andamento temporale dell'espressione della proteina nelle cellule HEK293.
2. Dopo trasfettando lo strato di cellule HEK293, aspirare i media dalle cellule al punto di tempo di post-trasfezione associato con più alto livello di espressione. Se questo si verifica entro le prime 24 ore, non aspirare fino a 24 ore dopo la trasfezione.
3. Lavare HEK293 cellule delicatamente con D-PBS poi aggiungere 500 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) e incubare a temperatura ambiente per 30 min. (Per rendere soluzione 4% PFA, iniziare con una soluzione al 16% in PBS 1X e diluire 1:4 con PBS 1X.)
4. Utilizzando PBS sterile, lavare delicatamente le cellule 3 volte in PBS e incubare O / N a 4 ° C.
5. Lavare le cellule 3 volte con PBS sterile, quindi aggiungere PBS e lasciare a 4 ° C fino al momento (tempo massimo di conservazione può variare a seconda della proteina espressa. Conserviamo cellule HEK293 trasfettate per esprimere neuroligin isoforme per un massimo di 2 settimane senza cambiamenti significativi effetti osservati sulla secrezione di insulina).

3. Co-coltura di INS-1 beta cellule con cellule HEK293

1. Preparare INS-1 media aggiungendo a 500 ml di RPMI 1640 (con glucosio e rosso fenolo e senza glutammina): 50 ml FBS, 5 ml 100X penicillina / streptomicina, 5 ml di soluzione di L-glutammina 100X, 5 ml di piruvato di sodio, 500 microlitri amfotericina B, 500 microlitri beta-mercaptoetanolo (questo è quasi identico al medium tipicamente utilizzato per la cultura isolotto primaria tranne per l'aggiunta di beta-mercaptoetanolo).
2. Utilizzando Cell-spogliarellista (o di un altro dispositivo di rimozione delle cellule non enzimatica), INS-1 raccogliere le cellule a circa il 70-80% di confluenza dal fondo di un pallone T75 cultura. Ogni pallone fornirà abbastanza grosso modo le cellule per 48 pozzetti.
3. Dopo la filatura giù cellule nella centrifuga per 3 minuti a 1200 rpm, risospendere in un mix di INS-1 e supporti HEK 50/50. Per un pallone 70-80% confluenti di cellule INS-1, risospendere in circa 25 ml di tecniche miste.
4. Se si utilizza cellule HEK293 che sono stati fissati in paraformaldeide piuttosto che HEK293 cellule vive, risospendere le cellule INS-1 in 100% INS-1 media, piuttosto che tecnica mista.
5. Usando una pipetta 10 ml, staccare le cellule dal pellet per fare una sospensione cellulare omogenea.
6. Aspirare a rimuovere il supporto sulle cellule HEK293.
7. Usando una pipetta p1000, delicatamente aggiungere 500 microlitri di INS-1 sospensione cellulare su strato di cellule HEK lungo i lati of il pozzo. Dopo ogni 6 pozzi, utilizzare una pipetta da 10 ml per risospendere nuovamente le cellule INS-1 per garantire una sospensione cellulare omogenea. Lo schema complessivo del coculture set-up è raffigurato in Figura 1.
8. Incubare le cellule per 24-48 ore a seconda del protocollo sperimentale.
9. Se è necessaria più di 48 ore periodo di co-coltura, utilizzare i passaggi opzionali nella sezione 2 sopra per fissare le cellule HEK293.
10. Se si utilizza roditore dissociato primaria o isole umane [per esempio vedere Protocolli precedenti in JoVE ^11-15], affinché un supporto appropriato, come RPMI con 5 ml pen / strep, 5 ml L-Glut, 0,5 ml di amfotericina-B viene utilizzato al posto di INS-1 media. Anche se si può usare cellule insulari dissociate in una piastra a 24, in pratica, a causa del gran numero di isolotti potenzialmente necessari, si raccomanda che si prenda in considerazione ridimensionamento di una piastra a 48 (che richiede un minor numero di cellule insulari per pozzetto). Su un piatto ben 48, aggiungere circa 100 isolotti valore di dissociazioneted cellule per piastra per iniziare. A seconda dell'efficacia della dissociazione e del metodo utilizzato, può essere richiesto un minor numero di isolotti.

4. Glucosio Stimolato secrezione di insulina

1. Preincubare cellule in 250 microlitri di 2.5 mM di glucosio nel KRB (tampone bicarbonato di Krebs-Ringer) per un minimo di 1 ora. Per Preincubare, rimuovere medio co-coltura e sostituire immediatamente con KRB. Questo scambio dovrebbe essere fatto un bene alla volta a ridurre al minimo l'esposizione di cellule INS-1 a ossigeno ambientale. Aspirare con una mano mentre pipettaggio il basso (2,5 mm) KRB glucosio con l'altra.
2. Scambio KRB preincubazione a 250 pl di 2,5 mM sia o 20 mM glucosio in KRB buffer di un pozzetto per volta.
3. Se appropriato per l'esperimento specifico, secretagoghi aggiuntivi come 100 pM IBMX possono essere aggiunti per produrre una più robusta insulina stimolata risposta secretoria. Isolotto primarie dissociate cellule beta in particolare, sono scarsamente sensibili ad un aumento delle concentrazioni di glucosio Alone, ecco specialmente aggiunta di IBMX o altri secretagoghi dovrebbe essere considerato ^16,17.
4. Dopo 1 ora di incubazione, trasferire mezzi di comunicazione per microcentrifuga tubi e spin 1.500 xg per 5 min.
5. Rimuovere 200 pl del supernatante e di utilizzare per l'analisi da insulina RIA o ELISA.
6. Per preparare lisato cellulare, aggiungere 100 microlitri di tampone RIPA lisi cellulare (150 mM NaCl, 1,0% IGEPALCA-630 o Nonidet P-40, 0,5% sodio desossicolato, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) con inibitori della proteasi per l' piastra immediatamente dopo aver rimosso media e incubare a 4 ° C per 20 min.
7. Spin down lisato per 15 min a 10.000 xg ed eliminare 50 ml di surnatante per l'analisi da insulina RIA o ELISA.

Risultati

Utilizzando il metodo descritto qui, è stato testato l'effetto delle diverse varianti del neuroligin proteina sulla secrezione di insulina. Questo completa la nostra opera pubblicata indagare l'effetto di neuroligin-2 sulla funzione delle cellule beta ^10. Figura 2, per esempio, descrive i risultati ottenuti da INS-1 coculturing beta cellule con cellule HEK293 transfettate per esprimere un neuroligin isoforma di cui qui come NL- X. Questo esperimento è stato progettato per verificare...

Discussione

Il metodo qui descritto coculture fornisce un modo efficace per determinare l'importanza fisiologica delle proteine ​​beta-superficie cellulare, transmembrana specifici, e specificatamente di loro domini extracellulari. Coltivando le cellule beta o cellule insulinoma (come gli INS-1 le cellule impiegate qui) a contatto con cellule HEK293 visualizzazione di una proteina di interesse sulla superficie delle cellule, esperimenti possono essere progettati per determinare gli effetti di interazioni proteina-proteina e...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
pcDNA 3.3 vector/backbone	Invitrogen	K830001
Lipofectamine 2000	Invitrogen	18324012
DMEM	Mediatech	45001-312
Pen/strep solution	Mediatech	45001-652-1
Amphotericin B	Mediatech	45001-808-1/30
RPMI-1640	Mediatech	45001-404
D-PBS	Mediatech	45001-434
Sodium Pyruvate	Mediatech	45001-710-1
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985023
Cell stripper	Mediatech	45000-668
T75 Flask	BD	1368065
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50980487
10X PBS	Mediatech	45001-130
Fetal bovine serum	Mediatech	MT35010CV
IBMX	Sigma	I5879-100MG
RIPA lysis buffer	Sigma	R0278