Analyse Coculture des interactions protéiques extracellulaires affecter la sécrétion d'insuline par les cellules bêta du pancréas

Résumé

Les interactions entre protéines transcellulaires sont des déterminants importants de la fonction des cellules bêta du pancréas. Détaillé ici est une méthode adaptée à partir d'un modèle de co-culture de synaptogénèse-pour étudier comment les protéines transmembranaires spécifiques influencent la sécrétion d'insuline. Cellules HEK293 transfectées expriment des protéines d'intérêt, les cellules bêta n'ont pas besoin d'être transfectées ou non directement perturbé.

Résumé

Les interactions entre les protéines de surface cellulaire aider à coordonner la fonction des cellules voisines. les cellules bêta du pancréas sont regroupés au sein des îlots pancréatiques et d'agir de manière coordonnée pour maintenir l'homéostasie du glucose. Il devient de plus en plus clair que les interactions entre protéines transmembranaires à la surface des cellules bêta adjacents sont des déterminants importants de la fonction des cellules bêta.

L'élucidation du rôle des interactions particulières transcellulaires par effet de choc, coup de grâce ou la surexpression des études dans les cellules bêta en culture ou in vivo nécessite perturbation directe de l'ARNm et l'expression des protéines, ce qui pourrait affecter la santé des cellules bêta et / ou la fonction d'une manière qui pourrait fausser les analyses des effets des interactions spécifiques. Ces approches modifient également les niveaux des domaines intracellulaires des protéines ciblées et peuvent prévenir les effets dus aux interactions entre protéines dans la même membrane cellulaire pour être affichéedistingué des effets des interactions transcellulaires.

Ici, un procédé pour déterminer l'effet des interactions spécifiques transcellulaires sur la capacité de sécréter de l'insuline et de la réactivité des cellules bêta est présenté. Cette méthode est applicable aux lignes des cellules bêta, comme les cellules INS-1, et pour les cellules bêta primaires dissociées. Il est basé sur des modèles développés par coculture neurobiologistes, qui ont trouvé que l'exposition des neurones en culture de protéines neuronales spécifiques exprimés sur HEK293 (ou COS) des couches de cellules protéines identifiées sont déterminantes pour stimuler la formation des synapses. Étant donné les parallèles entre les mécanismes de sécrétion des synapses neuronales et des cellules bêta, nous avons pensé que la maturation fonctionnelle des cellules bêta peut être entraînée par des interactions transcellulaires similaires. Nous avons développé un système où les cellules bêta sont cultivées sur une couche de cellules HEK293 exprimant une protéine d'intérêt. Dans ce modèle, le cytoplasme des cellules bêta est intact tandis extracellulaire INTERACTIONS de protéine-protéinens sont manipulés. Bien que nous nous concentrons ici principalement sur les études de glucose stimulée par la sécrétion d'insuline, d'autres procédés peuvent être analysés, par exemple, des changements dans l'expression des gènes tels que déterminés par immuno ou qPCR.

Introduction

Nous décrivons ici une méthode pour faciliter les enquêtes sur la façon dont les domaines extracellulaires de protéines transmembranaires spécifiques affectent la sécrétion d'insuline. La méthode des sondes les effets des interactions de la protéine d'intérêt avec des protéines (ou éventuellement d'autres molécules) sur la surface des cellules bêta pancréatiques. Le procédé permet des enquêtes de comment les protéines de surface cellulaire exprimée par des cellules bêta ou par d'autres cellules voisines (par exemple des cellules endothéliales, des neurones, des cellules alpha du pancréas) affectent la fonction des cellules bêta par des interactions transcellulaires (soit par des interactions avec des partenaires d'interaction sur la surface de côté cellules bêta).

La membrane de plasma cellulaire contient un ensemble complexe de protéines structurales et fonctionnelles servant de ponts pour le milieu extracellulaire. Par la formation de connexions transcellulaires ou par l'initiation des événements de signalisation en plastique, les interactions entre les protéines de surface cellulaire peuvent aider à coordonner l'la fonction des cellules voisines. les cellules bêta du pancréas sont regroupés dans les îlots pancréatiques et d'agir de manière coordonnée pour maintenir l'homéostasie du glucose ^1. Comme l'a révélé, par exemple, par l'importance des extracellulaire EPHA-ephrinA et neuroligin-2 interactions dans la régulation du glucose stimulée par la sécrétion d'insuline, il devient de plus en plus clair que l'augmentation de la connaissance des interactions extracellulaires qui se produisent entre les protéines sur les surfaces de côté cellules bêta seront d'une grande importance pour acquérir une compréhension complète de la sécrétion d'insuline, les bêta maturation fonctionnelle des cellules et le maintien de l'homéostasie du glucose ^1-3. Le but de la méthode décrite ici est de permettre à des enquêtes sur les effets sur la fonction des cellules bêta des interactions transcellulaires impliquant transmembranaire spécifique ou des protéines non-surface cellulaire associés. Par les cellules bêta co-culture avec des cellules HEK293 transfectées avec différentes constructions d'expression, les effets sur la bla fonction des cellules ETA de différentes protéines de surface cellulaire ou des variantes mutantes de celui-ci peut être sondé efficacement. Ceci est accompli sans avoir à transfecter les cellules bêta eux-mêmes.

L'élucidation du rôle des interactions particulières transcellulaires par effet de choc, coup de grâce ou la surexpression des études dans les cellules bêta en culture ou in vivo nécessite perturbation directe de l'ARNm des cellules bêta et l'expression des protéines, ce qui pourrait affecter la santé des cellules bêta et / ou la fonction d'une manière qui pourrait fausser l'analyse des les effets des interactions spécifiques extracellulaires. Ces approches également modifier les niveaux des domaines intracellulaires des protéines ciblées et, de plus, ne laissez pas les effets dus aux interactions entre protéines sur ou dans la même cellule à se distinguer des effets des interactions transcellulaires. Ici, un procédé pour déterminer l'effet des interactions spécifiques transcellulaires sur la capacité de sécréter de l'insuline et de la réactivité des cellules bêta est Described. Cette méthode est applicable aux lignes des cellules bêta qui sécrètent l'insuline, tels que les cellules INS-1, ⁴ et rongeurs primaire dissocié ou des cellules bêta humaines. Il est basé sur des modèles développés par coculture neurobiologistes, qui ont trouvé que l'exposition des neurones en culture à des protéines neuronales spécifiques exprimés sur HEK293 (ou COS) des couches de cellules pourrait identifier les protéines qui conduisent à la formation des synapses ^5,6. Étant donné les parallèles entre les mécanismes de sécrétion des synapses neuronales et des cellules bêta, nous avons pensé que la fonction des cellules bêta et la maturation fonctionnelle pourraient être conduits par des interactions similaires transcellulaires ^7-9. Afin de sonder ces interactions, nous avons développé le système décrit ici, dans lequel les cellules bêta sont co-cultivées sur une couche de cellules HEK293 exprimant une protéine d'intérêt ^10. Ce système permet le cytoplasme des cellules bêta de rester intact pendant des interactions protéine-protéine extracellulaire sont manipulés.

Protocole

1. La transfection de cellules HEK293 couche

1. Préparer milieu cellulaire HEK293 en ajoutant à bouteilles de 500 mL de DMEM (avec 4,5 g / ml de glucose et rouge de phénol et sans glutamine): 50 ml de FBS, 5 ml 100X pénicilline / solution de streptomycine, 5 ml de solution de L-glutamine 100x et 500 amphotéricine ul B.
2. Plate sur les cellules HEK293 dans une plaque de 24 puits en utilisant 0,5 ml de HEK293 médias par puits. S'assurer que les cellules sont réparties uniformément sur le fond de la plaque.
3. Lorsque les cellules HEK293 atteindre 100% de confluence, transfect avec 0,8 ug de plasmide codant la protéine d'intérêt (inséré dans un vecteur d'expression mammalien) et 2 ul de Lipofectamine 2000, selon le protocole Lipofectamine. Nous avons choisi d'utiliser le pcDNA 3.3 épine dorsale conçu pour l'expression dans les cellules de mammifères.
4. Eventuellement, après 6 heures d'incubation, échange les médias de transfection décrit dans le protocole Lipofectamine avec HEK293 médias normales.
5. Pour évaluer l'expression de la prote transfectéesdans un sous-ensemble des puits de culture tissulaire transfectées peut être utilisé pour la détection par immunofluorescence de la protéine exprimée ou pour l'analyse par Western blot de l'expression de protéines en utilisant des techniques standard.

2. Fixation facultative de cellules HEK293 exprimant la protéine transfectées

Cellules HEK293 transfectées peuvent être fixés doucement afin de faciliter co-culture dans les médias susceptibles de nuire à la vie des cellules HEK293 (par exemple étape 3.9 ci-dessous) ou pour permettre la préparation efficace à l'avance des plaques de plusieurs expériences à la fois (voir également la discussion).

1. Mener des études pilotes afin de déterminer l'évolution temporelle de l'expression de la protéine dans les cellules HEK293.
2. Après transfection de la couche de cellules HEK293, aspirer le support à partir des cellules au point de temps après la transfection associé à plus haut niveau d'expression. Si cela se produit dans les 24 premières heures, ne pas aspirer jusqu'à 24 heures après transfection.
3. Lavez HEK293 cellules doucement avec D-PBS puis ajouter 500 ul paraformaldéhyde 4% (PFA) et incuber à température ambiante pendant 30 min. (Pour faire une solution à 4% PFA, commencer avec une solution de 16% dans du PBS 1X et diluer à 1:4 avec du PBS 1X.)
4. Utiliser PBS stérile, laver délicatement les cellules 3 fois et les incuber dans du PBS O / N à 4 ° C.
5. Laver les cellules 3 fois avec du PBS stérile, puis ajouter PBS et laisser à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire (durée de stockage maximale peut varier en fonction de la protéine exprimée. Nous stockons des cellules HEK293 transfectées pour exprimer isoformes neuroligin pendant 2 semaines sans changements importants dans les effets observés sur la sécrétion d'insuline).

3. Co-culture de cellules INS-1 bêta avec cellules HEK293

1. Préparer INS-1 média en ajoutant à 500 ml de milieu RPMI 1640 (avec le glucose et le rouge de phénol et sans glutamine): 50 ml de FBS, 5 ml 100X pénicilline / streptomycine, 5 ml de solution 100X L-glutamine, 5 ml de pyruvate de sodium, 500 amphotéricine pl B, 500 pl bêta-mercaptoéthanol (ce qui est presque identique à la médecineum généralement utilisé pour la culture des îlots primaire à l'exception de l'ajout de bêta-mercaptoéthanol).
2. Utilisation de Cell-strip-teaseuse (ou un autre solvant de cellule non enzymatique), INS-1 récolte des cellules à environ 70-80% de confluence du fond d'un flacon de culture T75. Chaque flacon fournira suffisamment de cellules pour environ 48 puits.
3. Après filer vers le bas des cellules dans la centrifugeuse pendant 3 min à 1200 rpm, remettre en suspension dans un mélange 50/50 de l'INS-1 et médias HEK. Pour un flacon confluent de 70-80% des cellules INS-1, remettre en suspension dans environ 25 ml de médias mixtes.
4. Si vous utilisez des cellules HEK293 qui ont été fixés dans du paraformaldéhyde plutôt que des cellules vivantes HEK293, remettre en suspension les cellules INS-1 à 100% INS-1 médias plutôt que de techniques mixtes.
5. En utilisant une pipette de 10 ml, de déloger des cellules de la pastille pour faire une suspension de cellules homogène.
6. Aspirer à retirer le support sur les cellules HEK293.
7. Avec une pipette P1000, ajouter délicatement 500 pl de suspension cellulaire INS-1 sur la couche de cellules HEK le long des côtés of le puits. Après tous les 6 puits, utiliser une pipette de 10 ml pour remettre à nouveau les cellules INS-1 pour assurer une suspension de cellules homogène. L'économie générale de la co-culture set-up est représenté dans la figure 1.
8. Incuber les cellules pendant 24-48 heures selon le protocole expérimental.
9. Si plus de 48 période de coculture h est nécessaire, utiliser des étapes facultatives de la section 2 ci-dessus pour fixer les cellules HEK293.
10. Si vous utilisez rongeur dissocié primaire ou îlots humains [voir par exemple les protocoles antérieurs dans JoVE ^11-15], veiller à ce que des médias appropriés, tels que RPMI avec stylo 5 ml / streptomycine, 5 ml L-Glut, 0,5 ml d'amphotéricine-B est utilisé à la place de INS-1 médias. Même si on peut utiliser des cellules d'îlots dissociées dans une plaque à 24 puits, dans la pratique, en raison du grand nombre d'îlots potentiellement nécessaires, il est recommandé que l'on envisage de mise à l'échelle vers le bas sur une plaque à 48 puits (nécessitant moins de cellules des îlots pancréatiques par puits). Sur une plaque à 48 puits, ajouter environ 100 îlots de dollars de dissociationted cellules par plaque pour commencer. Selon l'efficacité de la dissociation et la méthode utilisée, moins d'îlots peuvent être nécessaires.

4. Glucose sécrétion d'insuline stimulée

1. Préincuber cellules dans 250 ul de 2,5 mM de glucose dans KRB (tampon bicarbonate de Krebs-Ringer) pour un minimum de 1 heure. Pour préincuber, éliminer le milieu de co-culture et remplacer immédiatement avec KRB. Cet échange devrait se faire un bien à la fois pour minimiser l'exposition des cellules INS-1 à l'oxygène de l'environnement. Aspirer avec une main pendant le pipetage le bas (2,5 mm) KRB de glucose avec l'autre.
2. Bourse pré-incubation KRB à 250 pi de 2,5 mM ou 20 mM de glucose dans KRB tampon d'un bien à un moment.
3. Le cas échéant, pour l'expérience spécifique, sécrétagogues supplémentaires telles que 100 um IBMX peuvent être ajoutés pour produire une réponse de sécrétion d'insuline stimulée plus robuste. Les cellules dissociées bêta des îlots pancréatiques primaires en particulier, sont mal répondre à l'augmentation des concentrations de glucose alone, alors voici surtout plus de IBMX ou autres sécrétagogues doit être considérée ^16,17.
4. Après 1 heure d'incubation, le milieu de transfert à Microfuge tubes et filent 1500 g pendant 5 min.
5. Retirer 200 pi du surnageant et l'utiliser pour l'analyse par l'insuline RIA ou ELISA.
6. Pour préparer lysat cellulaire, ajouter 100 ul de tampon de lyse cellulaire RIPA (NaCl 150 mM, 1,0% IGEPALCA-630 ou Nonidet P-40, 0,5% de désoxycholate de sodium, SDS 0,1%, Tris 50 mM, pH 8,0) avec les inhibiteurs de protéase pour le plaque immédiatement après avoir retiré les médias et incuber à 4 ° C pendant 20 min.
7. Isoler lysat pendant 15 min à 10000 xg et éliminer 50 pi de surnageant pour analyse par l'insuline RIA ou ELISA.

Résultats

En utilisant la méthode décrite ici, nous avons testé l'effet de différentes variantes de la neuroligin de protéines sur la sécrétion d'insuline. Cela complète notre travail publié étudier l'effet de neuroligin-2 sur la fonction des cellules bêta ^10. Figure 2, par exemple, décrit les résultats obtenus à partir INS-1 co-culture de cellules bêta avec des cellules HEK293 transfectées pour exprimer un neuroligin isoforme appelée ici NL- X. Cette expérience a été co...

Discussion

La méthode décrite ici co-culture est un moyen efficace pour déterminer l'importance physiologique de protéines beta-cell-surface, transmembranaires spécifiques, et en particulier de leurs domaines extracellulaires. Par les cellules bêta de culture ou de cellules d'insulinome (comme les cellules INS-1 utilisés ici) en contact avec les cellules HEK293 affichant une protéine d'intérêt sur la surface de la cellule, les expériences peuvent être conçues pour déterminer les effets des interactions pr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
pcDNA 3.3 vector/backbone	Invitrogen	K830001
Lipofectamine 2000	Invitrogen	18324012
DMEM	Mediatech	45001-312
Pen/strep solution	Mediatech	45001-652-1
Amphotericin B	Mediatech	45001-808-1/30
RPMI-1640	Mediatech	45001-404
D-PBS	Mediatech	45001-434
Sodium Pyruvate	Mediatech	45001-710-1
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985023
Cell stripper	Mediatech	45000-668
T75 Flask	BD	1368065
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50980487
10X PBS	Mediatech	45001-130
Fetal bovine serum	Mediatech	MT35010CV
IBMX	Sigma	I5879-100MG
RIPA lysis buffer	Sigma	R0278