通过胎盘的外来物质和纳米材料的运输率测定<em&gt;体外</em&gt;人胎盘灌注型号

摘要

该体外双循环人胎盘灌注模型可用于研究的整个人的胎盘转移的外源物和纳米颗粒。在这个视频协议中，我们描述了一个胎盘灌注成功执行所需的设备和技术。

摘要

几十年前的人胎盘被认为是一个难以逾越的障碍的母亲和未出生的孩子之间。然而，事后发现沙利度胺致出生缺陷和后来的许多研究证明相反。今天，一些有害的外来物质，如尼古丁，海洛因，美沙酮或描述克服这一障碍的药物，以及环境污染物。随着越来越多的利用纳米技术，胎盘可能接触到新颖的纳米粒子通过曝光是意外或故意的情况下，潜在的纳米药物应用。从动物实验数据，不能外推到人类，因为胎盘是最具体物种的哺乳动物器官^1。因此，于1967年^2，不断修改施耐德等。体外双循环人体胎盘灌注，开发等Panigel。于1972年^3，可以作为一个很好的T型车Ø研究外源性化学物质或微粒的转移。

在这里，我们专注于体外双循环人体胎盘灌注协议及其进一步发展，以获得可重复的结果。

获得知情同意后，无并发症的足月妊娠，剖腹产分娩的产妇的胎盘。一个完整的子叶胎儿和母体的血管插管灌注至少五个小时。作为一个模型颗粒大小为80，直径为500 nm的荧光标记聚苯乙烯颗粒中加入的产妇电路。 80纳米粒子能够穿过胎盘屏障，并提供一个完美的例子是通过胎盘到胎儿，而500纳米粒子被保留在胎盘组织或产妇电路的一种物质。 体外人类胎盘灌注模型提供可靠信息的少数机型之一运输外源性化学物质的行为，在一个重要的组织屏障，提供预测和临床相关数据。

引言

胎盘是一个复杂的器官，它是负责交换，氧气，二氧化碳，营养物和废物和在同一时间能够保持对母亲和胎儿生长彼此分开的两个血电路。此外，它可以防止由母体免疫系统排斥的孩子，并分泌激素，以维持妊娠。由^4,5无侧向细胞膜融合可以形成一个真正的合胞体滋养层细胞形成的细胞的屏障。整个胎盘组织在几个子叶，其中包含一个胎儿绒毛树，代表一个功能单元的胎盘。

胎盘屏障功能的研究，发现在1960年的沙利度胺致畸形加剧。出于显而易见的原因，易位研究孕妇，不能进行。因此，各种替代车型已经开发了^6,7 。最有前途的和可能是最临床相关模型是体外人类胎盘灌注模型开发Panigel和同事^2,3。

许多妇女面临不同的外来物质，如药物或环境污染物在怀孕期间^8。对于一些已经在怀孕期间定期给药的药物， 在体内研究中，可以通过的产妇与脐带血液中的血药浓度相比，。然而，一般只有有限的信息，这些物质在胎儿致畸的药动学和动力学。

例如阿片类药物，如海洛因容易穿过胎盘屏障，可导致胎儿宫内发育迟缓，早产或流产^9,10。因此，在丢失的情况下，节制在怀孕期间美沙酮的替代治疗的建议。 前体内的人类胎盘灌注模型透露，转移美沙酮进入胎儿循环是微不足道的^11，以及相关计算脐带血产妇血药浓度比分娩后^12。

纳米技术是一项不断发展的领域，尤其是药品。所以，自然发生的罚款 ​​（直径小于2.5微米）和超细微粒（直径小于0.1微米）的森林火灾，火山喷发的烟雾和沙尘，暴露于纳米材料工程（至少有一维小于0.1微米¹³下方）增加。有关工程纳米材料的毒理学潜力提出了疑问。虽然没有人类的危害还可以证明，也有主要的实验研究表明，工程纳米颗粒可引起不良的生物反应导致毒理学结果^14。最近，一些研究表明，产前暴露于空气污染与新生儿和儿童^15,16需要更高的呼吸道和呼吸道炎症。此外，小颗粒可能被用来作为药物载体，专门治疗胎儿或母亲。因此，它变得明显，需要广泛的研究，不同的外源性化学物质或纳米材料和他们有能力穿过胎盘屏障。在梅内塞斯等胎盘渗透到工程纳米材料的研究对当前实际的概述总结2011年¹⁷和Buerki Thurnherr 等。2012 ^7。

人体胎盘灌注模型的体外双循环提供了一个控制和可靠的系统研究胎盘胎盘范围广泛的其他功能，如各种内源性和外源性化合物^{3,11,12,18,19}和运输负责的机制开发先兆子痫的病理状态，如 ^{20-22。在这个协议中，我们主要集中在一套，处理和方法，使研究的积累，影响和移位率了一套广泛的外来物质或纳米颗粒。}

研究方案

1。准备灌注系统

1. 设置的水浴中，灌注腔室，两列进行氧合，两个蠕动泵，两个气泡陷阱，两个流加热器和一个压力传感器（ 图1）组成的灌注系统。这些组件连接起来的管路部分组成的硅树脂和聚氯乙烯的材料，根据图2中的方案。最后，还有两个分别代表胎儿和母体的电路，电路。
2. 打开水浴上，流动加热器和加热灌注室。温度应在37℃下
3. 热身灌注介质（NCTC-135组织培养基稀释1:2厄尔的缓冲液（6.8克/ L盐水，0.4 g / L的氯化钾，0.14 g / L的磷酸二氢钠，硫酸镁0.2克/升，0.2克/ L的氯化钙，2 g / L的葡​​萄糖）葡萄糖（1克/升），右旋糖酐40（10克/升），牛血清白蛋白（10克补充/ L）的钠，肝素（2500 IU / L），阿莫西林（250毫克/升）和碳酸氢钠（2.2克/升），pH 7.4）中，在水浴。
4. 连续再次冲洗动脉系统的胎儿和母体的电路）200毫升蒸馏水，二）50毫升1％的氢氧化钠，三）1％磷酸和d）200毫升蒸馏水中（流速：15 - 20毫升/分钟）。
5. 胎儿的连接套管（直径1.2毫米，钝针应该连接到修改后的翅针输液器）到胎儿动脉导管。
6. 灌注液冲洗动脉胎儿和母体的电路系统，直到所有的管子包含介质（流速：15〜20毫升/分钟）。在这一步填补了泡沫陷阱除去所有气泡下游的陷阱。然后停止泵。这是非常重要的入球小动脉管始终无气泡，否则插管后，特别是细胎儿血管破裂。
7. 打开的气体流。产妇电路被氧化无线第5％二氧化碳和95％与5％二氧化碳和95％氮气的的合成空气和胎儿电路。
8. 开始录音的压力传感器。

2。插管胎盘

1. 获得完整初级剖宫产无并发症的足月妊娠后胎盘。给予书面同意（我们的研究中得到的情况下）由母亲分娩前的研究，必须由当地伦理委员会的批准（在我们的研究的情况下）。第一视觉控制应该由助产士，以确保一个健康的和完整的胎盘。
2. 插管胎盘是关键的一步！在灌注组织中的每一个细小的中断可导致孕产妇和胎儿的血液循环之间的泄漏。胎盘具有以下方式获得分娩后30分钟内。
3. 选择一个完整的无可见中断对产妇胎盘子叶边缘区。在绒毛膜板块，同时配合相关的上游通过手术缝合材料后插管侧（朝向脐带）脐动脉和静脉的分支。总是使两个结。
4. 首先胎儿动脉导管插入。胎儿胎盘动脉总是比静脉更小，更薄。
5. 使胎儿动脉周围缝合，但不把它立即。保持容器用一个镊子，仔细切断船只，并把小动脉套管（直径1.2毫米）。然后配合缝合（两节）。
6. 胎儿静脉中相同的方式继续进行，但使用一个更大的套管（直径1.5-1.8毫米;钝针应附加到的变形的翅针输液器）。
7. 打开胎儿泵（2毫升/分钟）。如果没有可见的泄漏和血液来源于胎儿静脉插管，慢慢增加至4毫升/分钟的流量。观察胎儿动脉中的压力，它不应该超过70毫米汞柱。如果液体泄漏在胎儿或配偶的RNAL套管修复他们与另一缝合。
8. 将胎盘组织人与胎侧拉的胎盘膜和组织在尖峰。在最后的灌注子叶应该在中间的组织保持器的孔中。
9. 稳定的部分，其中只有持有胎盘膜用硅胶膜（直径1毫米），或者两个封口膜件。
10. 组装完整的组织支架，拧紧螺丝，并切割悬垂组织。请注意，静脉和动脉插管不捏，而是组织持有人躺在小通道。
11. 将纸巾架倒挂，把它放进灌注室，并加盖。现在，产妇方应在顶部。经常检查，如果胎儿的电路仍然保存完好，介质流出来的胎儿静脉管。
12. 打开的的产妇泵（12毫升/分钟）。介绍了三个钝套管（直径0.8毫米）日e结束产妇的动脉管入间隙穿透蜕膜板。返回灌流产妇电路一管静脉漏，这也与产妇泵灌注室的上部的最低位置。
13. 连接胎儿的静脉插管，胎儿静脉管。

3。执行前和实验阶段灌注

1. 为了使组织恢复缺血期分娩后，冲洗掉血液中的间隙，一个开放的相前的20分钟是必要的。这意味着产妇和胎儿的静脉不会导致动脉水库灌注介质。收集胎儿和母体静脉流出并将其丢弃在一个瓶子经过前期相。
2. 灌注的完整性，以评估执行另一个预定阶段20分钟，但在一个封闭的回路。使用两个独立的水库灌注液胎儿和母体的电路，导致胎儿的静脉流出，早在胎儿水库和母亲静脉血流出早在母体水库关闭电路。
3. 对于主灌注实验准备两个烧瓶中，用120ml灌注培养基（一个为母体和胎儿水库）。添加放射性标记的¹⁴ C-安替比林（4 NCI /毫升;作为阳性对照;注意：放射性物质）和荧光标记的外源性或纳米颗粒要分析产妇水库。以及混合产妇灌流。
4. 纯灌注介质交换两个准备瓶（胎儿和产妇水库）开始实验。关闭电路，导致胎儿的静脉流出早在胎儿水库和母亲静脉血流出早在母体水库。
5. 继续灌注6小时，并定期采取样本。始终悬浮介质中的胎儿和产妇水库前撤回。
6. 灌注过程中的胎儿的动脉（应不超过70毫米汞柱），在两个电路中的pH值（应该是在生理范围内,7.2-7 .4）和两个水塘的体积（，胎儿体积损失不应超过4毫升/小时）中的压力控制。如果有必要，可以使用盐酸或氢氧化钠调节pH值。
7. 如果在胎儿储层的体积损失超过4毫升/小时，在组织中会出现泄漏，停止灌注。 6小时无泄漏灌注的成功率是15-20％左右。
8. 6小时后停止灌注。关闭泵，水浴，流量加热器和气体流量。
9. 取出胎盘组织人，削减灌注的子叶（亮比unperfused组织）和称重。
10. 抽取样本unperfused（部分的胎盘，在开始切割过程中已经采取预相）和灌注组织（约1克），并将其储存在-20°C直至均匀化，或在液氮中用于以后的分析。修复另一个组织样本在4％福尔马林组织病理学评估。样品应包括所有层的胎盘。
11. 清洁管灌注后依次漂洗动脉系统的胎儿和母体电路）200毫升蒸馏水，B），50毫升1％的氢氧化钠，三）50毫升1％的磷酸和d）200毫升的蒸馏水再（流量：15〜20毫升/分钟）。

胎盘灌注实验的整个工作过程的图3中描述。

4。分析样品

1. 以800×g的10分钟离心灌流液的样品在分析前以除去残余的红细胞。取上清液进行进一步的分析。可将样本在4℃下放置过夜如果在的瘦素和hCG生产的分析，可将样本存储于-20℃。
2. 透性来评估的胎盘液体闪烁分析¹⁴ C-安替比林。混合300微升的胎儿和母体样品用3ml闪烁鸡尾酒和测量5分钟，用β-计数器。
3. 为了评估转移的荧光纳米颗粒或还异生在485 nm激发波长，528发射波长，用酶标仪（表示波长进行分析，我们使用的纳米粒子的黄色的绿色标签）读取荧光。
4. 为了确定胎盘组织灌注过程中测量的葡萄糖消耗和乳酸生产中的胎儿和产妇的电路与自动化血气系统的可行性。此外，评估生产人类choriongonadotropin胎盘激素（hCG）的组织匀浆样品的灌流液，用酶联免疫吸附试验（ELISA）和瘦素。

结果

图4A显示小的聚苯乙烯颗粒（80纳米）相比更大的聚苯乙烯颗粒（500纳米），不会转移到胎儿车厢被运往通过胎盘灌注曲线。每个数据点代表给定的时间点中的至少3个独立实验的平均颗粒浓度。聚苯乙烯纳米粒子胎盘传输大小依赖^19。胎盘灌注3小时后，已经有20-30％的最初加入80纳米的聚苯乙烯颗粒是从母体转移到胎儿的电路，而500纳米的聚苯乙烯颗粒没有出现在胎儿的电路?...

讨论

这里显示下方的双循环灌流，还有其他一些可能的实验配置取决于必须回答的问题。常用特别开放的胎盘灌注，稳态浓度³评估药物清除。的循环灌流设置也可以应用于，确认主动运输的内源性或外源性物质。对于这种方法的生物外源性的相同浓度的已被添加到母亲和胎儿循环。假定不存在逆浓度梯度的主动转运，可以观察到的两个电路中的任一个被检物质的积累^24。值得注意的是...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCTC-135 medium	ICN Biomedicals, Inc.	10-911-22C	could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769)
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich, Fluka	71381
Potassium chloride (KCl)	Hospital pharmacy		also possible: Sigma (P9541)
Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O)	Merck	106346
Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O)	Sigma-Aldrich, Fluka	63139
Calcium chloride (CaCl, anhydrous)	Merck	102388
D(+) Glucose (anhydrous)	Sigma-Aldrich, Fluka	49138
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck	106329
Dextran from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	31389
Bovine serum albumin (BSA)	Applichem	A1391
Amoxicilline (Clamoxyl)	GlaxoSmithKline AG	2021101A
Sodium heparin	B. Braun Medical AG	3511014
Sodium hydoxide (NaOH) pellets	Merck	106498	CAUTION: corrosive
Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4)	Merck	100573	CAUTION: corrosive
Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2	PanGas AG
Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2	PanGas AG
Antipyrine (N-methyl-14C)	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ARC 0108-50 μCi	CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol)
Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus)	Zinsser Analytic GmbH	1003100
Polystyrene particles 80 nm	Polyscience, Inc.	17150
Polystyrene particles 500 nm	Polyscience, Inc.	17152
EQUIPMENT
Water bath	VWR	462-7001
Thermostat	IKA-Werke GmbH Co. KG	3164000
Peristaltic pumps	Ismatec	ISM 833
Bubble traps (glass)	UNI-GLAS Laborbedarf
Flow heater	UNI-GLAS Laborbedarf
Pressure sensor + Software for analyses	MSR Electronics GmbH	145B5
Notebook	Hewlett Packard
Miniature gas exchange oxygenator	Living Systems Instrumentation	LSI-OXR
Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm)	Ismatec	MF0028
Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm)	Ismatec	SC0744
Blunt cannulae ( 0.8 mm)	Polymed Medical Center	03.592.81
Blunt cannulae ( 1.2 mm)	Polymed Medical Center	03.592.90
Blunt cannulae ( 1.5 mm)	Polymed Medical Center	03.592.94
Blunt cannulae ( 1.8 mm)	Polymed Medical Center	03.952.82
Parafilm	VWR	291-1212
Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass)	Internal technical department		Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK
Surgical suture material (PremiCron)	B. Braun Medical AG	C0026005
Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly)	Hospira, Inc.	ASN 2102
Multidirectional stopcock (Discofix C-3)	B. Braun Medical AG	16494C
Surgical scissors	B. Braun Medical AG	BC304R
Dissecting scissors	B. Braun Medical AG	BC162R
Needle holder	B. Braun Medical AG	BM200R
Dissecting forceps	B. Braun Medical AG	BD215R
Automated blood gas system	Radiometer Medical ApS	ABL800 FLEX
Multi-mode microplate reader	BioTek	Synergy HT
Liquid scintillation analyzer	GMI, Inc.	Packard Tri-Carb 2200
Scintillation tubes 5.5 ml	Zinsser Analytic GmbH	3020001
Tissue Homogenizer	OMNI, Inc.	TH-220
pH meter + electrode	VWR	662-2779