Determinación de la velocidad de transporte de xenobióticos y Nanomateriales través de la placenta mediante el<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo perfusión placentaria humana

Resumen

La Ex vivo Modelo de perfusión placentaria humana de doble recirculación se puede utilizar para investigar la transferencia de xenobióticos y nanopartículas a través de la placenta humana. En este protocolo de vídeo se describe el equipo y las técnicas requeridas para una ejecución exitosa de una perfusión de la placenta.

Resumen

Hace que la placenta humana Décadas se pensaba que era una barrera impenetrable entre la madre y el niño por nacer. Sin embargo, el descubrimiento de defectos congénitos inducidos por la talidomida y muchos estudios posteriores después demostró lo contrario. Hoy varios xenobióticos perjudiciales como la nicotina, la heroína, la metadona o medicamentos, así como los contaminantes ambientales fueron descritos para superar esta barrera. Con el creciente uso de la nanotecnología, es probable que entre en contacto con nuevas nanopartículas ya sea accidental o intencionalmente a través de la exposición en el caso de posibles aplicaciones nanomédicos la placenta. Los datos de los experimentos con animales no se pueden extrapolar a los seres humanos debido a que la placenta es el órgano específico de la especie de mamífero más ^1. Por lo tanto, la ex vivo de doble recirculación de la perfusión placentaria humana, desarrollado por Panigel et al. ² en 1967 y modificada continuamente por Schneider et al. En 1972 ^3, puede servir como un modelo excelente to Estudio de la transferencia de xenobióticos o partículas.

Aquí, nos centramos en la doble ex vivo recirculación protocolo de perfusión placentaria humana y su desarrollo para adquirir resultados reproducibles.

La placenta se obtuvieron después de consentimiento informado de las madres de embarazos sin complicaciones término, sometidas a cesárea. Los vasos fetales y maternos de una cotiledones intactos se canularon y perfundidos por lo menos durante cinco horas. Como modelo de partículas se añaden partículas de poliestireno etiqueta fluorescente con tamaños de 80 y 500 nm de diámetro para el circuito maternal. Las partículas de 80 nm eran capaces de cruzar la barrera placentaria y proporcionar un ejemplo perfecto para una sustancia que se transfiere a través de la placenta hasta el feto, mientras que las partículas de 500 nm fueron retenidos en el tejido de la placenta o el circuito materna. El modelo de la perfusión placentaria humana ex vivo es uno de los pocos modelos que proporcionan información fiable sobreel comportamiento de transporte de xenobióticos en una barrera de tejido importante que entrega datos predictivos y clínicos pertinentes.

Introducción

La placenta es un órgano complejo que es responsable para el intercambio de oxígeno, dióxido de carbono, nutrientes y productos de desecho y, al mismo tiempo capaz de mantener los dos circuitos de la sangre de la madre y el feto en crecimiento separados el uno del otro. Además, se previene el rechazo del niño por el sistema inmune materna y secreta las hormonas para mantener el embarazo. La barrera celular está formada por las células citotrofoblastos que se fusionan y forman un verdadero sincitio sin membranas celulares laterales ^4,5. Toda la placenta está organizada en varios cotiledones, que contienen un árbol velloso fetal y representan una unidad funcional de la placenta.

El estudio de la función de barrera de la placenta se intensificó con el descubrimiento de las malformaciones inducidas por la talidomida en la década de 1960. Por razones obvias, los estudios de translocación con las mujeres embarazadas no pueden realizarse. En consecuencia, varios modelos alternativos han sido desarrollados ^6,7 . El modelo relevante más prometedor y probablemente más clínica es el modelo de perfusión ex vivo de placenta humana desarrollado por Panigel y compañeros de trabajo ^2,3.

Muchas mujeres están expuestas a diferentes xenobióticos como las drogas o los contaminantes ambientales durante el embarazo ^8. Para algunos medicamentos que ya se les administró regularmente durante el embarazo, en los estudios in vivo se puede realizar por comparación de la concentración en sangre materna con el que, en la sangre del cordón umbilical. Sin embargo, por lo general sólo hay información limitada sobre la farmacocinética y-dinámica en el feto y la teratogenicidad de estas sustancias.

Por ejemplo los opiáceos como la heroína atraviesa fácilmente la barrera placentaria y puede conducir a la restricción del crecimiento intrauterino, parto prematuro o aborto espontáneo ^9,10. Por lo tanto, en caso de falta de abstinencia durante el embarazo se recomienda una terapia de reemplazo con la metadona. El exmodelo de perfusión placentaria humana in vivo reveló que la transferencia de la metadona en la circulación fetal es insignificante ^11, que se correlaciona bien con la sangre-a-materna relación de concentración calculada de sangre de cordón después de la entrega ^12.

La nanotecnología es un campo cada vez mayor, especialmente en medicina. Así, bajo la forma natural fino (<2,5 m de diámetro) y las partículas ultrafinas (<0,1 m de diámetro) en los humos de los incendios forestales, erupciones volcánicas y polvo del desierto, la exposición a nanomateriales artificiales (al menos una dimensión <0,1 micras ¹³ ) es cada vez mayor. Esto plantea preguntas sobre el potencial toxicológico de los nanomateriales artificiales. Aunque no hay peligro humana pudo comprobar, sin embargo, hay estudios experimentales principales que indican que las nanopartículas artificiales pueden causar reacciones biológicas adversas que conducen a resultados toxicológicos ^14. Recientemente, algunos estudios indican que la exposición prenatal a lala contaminación del aire está ligada a una necesidad respiratoria superior y la inflamación de las vías en los recién nacidos y los niños ^15,16. Además, pequeñas nanopartículas pueden ser utilizados como portadores de fármacos para tratar específicamente ya sea el feto o la madre. Por lo tanto, se hace evidente que se requieren extensos estudios de xenobióticos o nanomateriales distintos y su capacidad para cruzar la barrera placentaria. Una visión actual de los estudios actuales sobre la permeabilidad de la placenta a los nanomateriales artificiales se resume en Menezes et al. 2011 ¹⁷ y Buerki-Thurnherr et al. 2012 ^7.

El doble ex vivo de recirculación modelo de perfusión placentaria humana proporciona un sistema controlado y fiable para el estudio del transporte placentario de diversos compuestos endógenos y exógenos ^{3,11,12,18,19} y una amplia gama de otras funciones de la placenta como mecanismos responsables de la desarrollo de estados patológicos como preeclampsia ^{20-22. En este protocolo nos centramos principalmente en la puesta a punto, el manejo y el método que permite el estudio de la acumulación, los efectos y las tasas de translocación de un conjunto amplio de xenobióticos o nanopartículas.}

Protocolo

1. Preparación del sistema de perfusión

1. Configurar el sistema de perfusión que consiste en un baño de agua, una cámara de perfusión, dos columnas para la oxigenación, dos bombas peristálticas, dos trampas de burbujas, dos calentadores de flujo y un sensor de presión (Figura 1). Conectar estos componentes con secciones de tubo compuestas de los materiales de cloruro de polivinilo de silicona y de acuerdo con el esquema de la figura 2. Por último, hay dos circuitos que representan el circuito fetal y materna, respectivamente.
2. Encienda el baño de agua, los calentadores de paso y el calentamiento de la cámara de perfusión. La temperatura debe ser de 37 ° C.
3. Calentar el medio de perfusión (NCTC-135 medio de cultivo tisular se diluyó 1:02 con tampón de Earle (6,8 g / l de cloruro sódico, 0,4 g / L de cloruro de potasio, 0,14 g / l de fosfato monosódico, 0,2 g / L de sulfato de magnesio, 0,2 g / L de cloruro de calcio, 2 g / l de glucosa) suplementado con glucosa (1 g / L), dextrano 40 (10 g / L), albúmina de suero bovino (10 g/ L), heparina sódica (2.500 UI / L), amoxicilina (250 mg / L) y bicarbonato de sodio (2,2 g / L), pH 7,4) en el baño de agua.
4. Consecutivamente enjuagar los sistemas arterial del circuito fetal y materna con a) 200 ml de agua destilada, b) 50 ml de hidróxido sódico 1%, c) 1% de ácido fosfórico y d) de nuevo 200 ml de agua destilada (velocidad de flujo: 15 - 20 ml / min).
5. Conectar la cánula fetal (Ø 1,2 mm; aguja de punta roma debe estar unido a un equipo de infusión de aguja con aletas modificado) a la tubería arterial fetal.
6. Enjuague los sistemas arterial del circuito fetal y materna con medio de perfusión hasta que todos los tubos contienen medio (velocidad de flujo: 15-20 ml / min). Durante esta etapa de llenar las trampas de burbujas y eliminar todas las burbujas de aguas abajo de la trampa. A continuación, dejar las bombas. Es muy importante que los tubos arteriales aferentes siempre están libres de burbujas, de lo contrario después de la canalización en especial los vasos fetales finos pueden romperse.
7. Encienda el flujo de gas. El circuito de la madre se oxigena wiª dióxido de carbono al 5% y aire sintético 95% y el circuito fetal con dióxido de carbono 5% y 95% de nitrógeno.
8. Iniciar la grabación del sensor de presión.

2. Canulación de la Placenta

1. Obtener la placenta intacta de embarazos sin complicaciones plazo después de una cesárea primaria. El consentimiento por escrito tiene que ser dado (se obtuvo en el caso de los estudios) por las madres antes del parto y el estudio tiene que ser aprobado por el comité de ética local (en el caso en nuestros estudios). En primer control visual debe ser realizado por las parteras para asegurar una placenta sana e intacta.
2. La canulación de la placenta es un paso crítico! Durante la perfusión cada pequeña perturbación en el tejido puede dar lugar a una fuga entre la circulación materna y fetal. La placenta tiene que ser obtenido dentro de 30 min después de la entrega.
3. Seleccione un cotiledones intactos en la zona marginal de la placenta sin interrupciones visibles en el lado materno. En la placa coriónica,atar las dos ramas asociadas de la arteria y vena umbilical aguas arriba hacia el lado canulación más adelante (hacia el cordón umbilical) mediante el uso de material de sutura quirúrgica. Haga siempre dos nudos.
4. Canular la arteria fetal primero. Las arterias placentarias fetales son siempre más pequeña y más delgada que las venas.
5. Hacer una sutura alrededor de la arteria fetal, pero no lo ate para arriba inmediatamente. Mantenga el recipiente con una pinza, corte el recipiente con cuidado y poner la cánula pequeña (Ø 1,2 mm) en la arteria. Luego atar la sutura (dos nudos).
6. Proceder con la vena del feto de la misma manera pero el uso de una cánula más grande (Ø 1.5 a 1.8 mm; aguja de punta roma debe estar unido a un equipo de infusión de aguja con aletas modificado).
7. Encienda la bomba fetal (2 ml / min). Si no hay ninguna fuga visible y la sangre emana de la cánula de la vena fetal, poco a poco aumentar el flujo de hasta 4 ml / min. Observe la presión en la arteria fetal, no debe exceder de 70 mm Hg. Si las fugas de líquido hacia fuera en el feto o de yerba materno cánula que arreglar con otra sutura.
8. Coloque la placenta en el soporte del tejido con el lado fetal y tirar de la membrana placentaria y el tejido a través de los picos. En el extremo del cotiledón perfundido debe estar en el centro del agujero en el soporte de tejido.
9. Estabilizar la parte en la que sólo la membrana tiene la placenta con una membrana de silicona (Ø 1 mm) o como alternativa dos piezas parafilm.
10. Monte el sostenedor del tejido completo, apretar los tornillos y cortar el tejido sobresaliente. Tenga en cuenta que la cánula venosa y arterial no queden atrapados sino que ponen en los pequeños canales del sostenedor del tejido.
11. Gire el soporte del tejido al revés, lo puso en la cámara de perfusión y agregue la cubierta. Ahora, del lado materno debe estar en la parte superior. Compruebe siempre si el circuito fetal es todavía intacta y el medio está fluyendo fuera de la tubería de la vena fetal.
12. Encienda la bomba de la madre (12 ml / min). Introducir los tres contundente cánulas (Ø 0,8 mm) en el thfinal e del tubo arterial materna en el espacio intervellosa al penetrar la placa decidual. Para devolver el líquido de perfusión en el circuito materna puso un tubo de drenaje venoso como que también está conectado con la bomba materna a la posición más baja en la parte superior de la cámara de perfusión.
13. Conectar la cánula de la vena fetal al tubo vena fetal.

3. La ejecución de la pre y la Fase Experimental de la perfusión

1. Para permitir que el tejido se recupere del período isquémico después del parto, y para eliminar la sangre en el espacio intervellosa, una pre-fase abierta de 20 min es necesario. Eso significa que la vena materna y fetal no se conduce de nuevo al depósito arterial que contiene el medio de perfusión. Recoger el flujo de salida venoso fetal y materna en una botella y desecharla después de la pre-fase.
2. Para evaluar la integridad de la perfusión realizar otra pre-fase de 20 minutos, pero en un circuito cerrado. Usa dos depósitos separados con medio de perfusiónpara el circuito fetal y materna y cerrar los circuitos, llevando el flujo venoso fetal de nuevo en el depósito del feto y la parte posterior del flujo venoso materna en el depósito materna.
3. Para el experimento principal perfusión preparar dos frascos con 120 ml de medio de perfusión (uno para la madre y el otro para el depósito del feto). Agregue el radiomarcado ¹⁴ C-antipirina (4 nCi / ml; sirve como control positivo; PRECAUCIÓN: sustancia radiactiva) y el xenobióticos o nanopartículas marcado con fluorescencia que se quiere analizar al depósito materna. Mezcle el líquido de perfusión materna así.
4. Comience el experimento cambiando el medio de perfusión puro con los dos frascos preparados (depósitos fetales y maternas). Cerrar los circuitos, llevando el nuevo flujo venoso fetal en el depósito del feto y la parte posterior del flujo venoso materna en el depósito materna.
5. Continuar la perfusión durante 6 horas y tomar muestras de forma regular. Siempre resuspender el medio en el fetal y maternadepósito antes de la retirada.
6. Control de la presión en la arteria fetal (no debe exceder de 70 mm de Hg), pH en ambos circuitos (debe estar en un rango fisiológico 7.2 a 7.4) y el volumen de ambos depósitos (pérdida de volumen fetal no debe exceder de 4 ml / h) durante la perfusión . Si es necesario ajustar los valores de pH con el ácido clorhídrico o hidróxido de sodio.
7. Si la pérdida de volumen en el depósito fetal supera los 4 ml / hr hay una fuga en el tejido y uno tiene que parar la perfusión. La tasa de éxito de una perfusión durante 6 horas sin pérdida es de aproximadamente 15-20%.
8. Detenga la perfusión después de 6 horas. Apague las bombas, baño de agua, calentadores de flujo y el flujo de gas.
9. Retire la placenta del sostenedor del tejido, corte el cotiledón perfundido (más brillante que el tejido unperfused) y pesarlo.
10. Tomar muestras de unperfused (parte de la placenta que fue cortada en el principio; podría ser ya tomada durante la fase de pre-) y tejido perfundido (cada uno de aproximadamente 1 g) y almacenar a -20 ° Chasta homogeneización o en nitrógeno líquido para su posterior análisis. Fijar otra muestra de tejido en formalina al 4% para la evaluación histopatológica. Las muestras deben incluir todas las capas de la placenta.
11. Limpiar los tubos después de la perfusión de un enjuague sucesivamente los sistemas arterial del circuito fetal y materna con: a) 200 ml de agua destilada, b) 50 ml de hidróxido sódico 1%, c) 50 ml de 1% de ácido fosfórico y d) de nuevo 200 ml de agua destilada (caudal: 15 a 20 ml / min).

Todo el procedimiento de trabajo del experimento de perfusión placenta se representa en la Figura 3.

4. Análisis de las Muestras

1. Centrifugar las muestras de perfundido durante 10 min a 800 xg antes del análisis para eliminar los eritrocitos residuales. Tome el sobrenadante para el análisis ulterior. Las muestras se pueden dejar durante la noche a 4 ° C. Para el análisis de la producción de leptina y hCG las muestras se pueden almacenar a -20 ° C.
2. Para evaluar la permeabilidad de laplacenta analizar la C-antipirina ¹⁴ por centelleo líquido. Mezclar 300 l de las muestras fetal y materna con 3 ml de cóctel de centelleo y medida durante 5 min en un contador beta.
3. Para evaluar la transferencia de las nanopartículas fluorescentes o el xenobiótico de interés leer la fluorescencia a 485 nm de excitación y 528 nm de emisión en un lector de microplacas (longitudes de onda indicadas son para el análisis de la etiqueta verde amarillo, que se utilizó para las nanopartículas).
4. Para determinar la viabilidad del tejido de la placenta durante la medida de la perfusión el consumo de glucosa y producción de lactato en el circuito fetal y materna con un sistema automatizado de gases en sangre. Además, evaluar la producción de hormonas de la placenta humana choriongonadotropin (hCG) y la leptina en las muestras de tejido homogeneizadas y los perfundidos por ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

Resultados

La Figura 4A muestra los perfiles de perfusión de partículas de poliestireno pequeñas (80 nm) que se transportan a través de la placenta en comparación con partículas de poliestireno más grandes (500 nm) que no fueron transferidos al compartimento fetal. Cada punto de datos representa la concentración media de partículas hasta el punto de tiempo dado de al menos 3 experimentos independientes. Para obtener nanopartículas de poliestireno de la transferencia placentaria es dependiente de la talla...

Discusión

Debajo de la perfusión recirculante dual mostró aquí, hay varias otras configuraciones experimentales posibles dependiendo de la pregunta que hay que responder. Perfusiones placentarios Particularmente abiertos se utilizan comúnmente para evaluar el aclaramiento del fármaco a una concentración de estado estacionario ^3. La perfusión recirculante de configuración se puede aplicar también para confirmar transporte activo de sustancias endógenas o exógenas. Para este enfoque, la misma concentración de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCTC-135 medium	ICN Biomedicals, Inc.	10-911-22C	could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769)
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich, Fluka	71381
Potassium chloride (KCl)	Hospital pharmacy		also possible: Sigma (P9541)
Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O)	Merck	106346
Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O)	Sigma-Aldrich, Fluka	63139
Calcium chloride (CaCl, anhydrous)	Merck	102388
D(+) Glucose (anhydrous)	Sigma-Aldrich, Fluka	49138
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck	106329
Dextran from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	31389
Bovine serum albumin (BSA)	Applichem	A1391
Amoxicilline (Clamoxyl)	GlaxoSmithKline AG	2021101A
Sodium heparin	B. Braun Medical AG	3511014
Sodium hydoxide (NaOH) pellets	Merck	106498	CAUTION: corrosive
Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4)	Merck	100573	CAUTION: corrosive
Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2	PanGas AG
Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2	PanGas AG
Antipyrine (N-methyl-14C)	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ARC 0108-50 μCi	CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol)
Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus)	Zinsser Analytic GmbH	1003100
Polystyrene particles 80 nm	Polyscience, Inc.	17150
Polystyrene particles 500 nm	Polyscience, Inc.	17152
EQUIPMENT
Water bath	VWR	462-7001
Thermostat	IKA-Werke GmbH Co. KG	3164000
Peristaltic pumps	Ismatec	ISM 833
Bubble traps (glass)	UNI-GLAS Laborbedarf
Flow heater	UNI-GLAS Laborbedarf
Pressure sensor + Software for analyses	MSR Electronics GmbH	145B5
Notebook	Hewlett Packard
Miniature gas exchange oxygenator	Living Systems Instrumentation	LSI-OXR
Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm)	Ismatec	MF0028
Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm)	Ismatec	SC0744
Blunt cannulae ( 0.8 mm)	Polymed Medical Center	03.592.81
Blunt cannulae ( 1.2 mm)	Polymed Medical Center	03.592.90
Blunt cannulae ( 1.5 mm)	Polymed Medical Center	03.592.94
Blunt cannulae ( 1.8 mm)	Polymed Medical Center	03.952.82
Parafilm	VWR	291-1212
Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass)	Internal technical department		Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK
Surgical suture material (PremiCron)	B. Braun Medical AG	C0026005
Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly)	Hospira, Inc.	ASN 2102
Multidirectional stopcock (Discofix C-3)	B. Braun Medical AG	16494C
Surgical scissors	B. Braun Medical AG	BC304R
Dissecting scissors	B. Braun Medical AG	BC162R
Needle holder	B. Braun Medical AG	BM200R
Dissecting forceps	B. Braun Medical AG	BD215R
Automated blood gas system	Radiometer Medical ApS	ABL800 FLEX
Multi-mode microplate reader	BioTek	Synergy HT
Liquid scintillation analyzer	GMI, Inc.	Packard Tri-Carb 2200
Scintillation tubes 5.5 ml	Zinsser Analytic GmbH	3020001
Tissue Homogenizer	OMNI, Inc.	TH-220
pH meter + electrode	VWR	662-2779