Determinação da taxa de transporte de xenobióticos e nanomateriais através da placenta usando o<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de perfusão da placenta humana

Resumo

O Ex vivo Modelo de perfusão de recirculação dupla placenta humana pode ser utilizada para investigar a transferência de xenobióticos e nanopartículas pela placenta humana. Neste protocolo de vídeo que descreve o equipamento e as técnicas necessárias para uma boa realização de uma perfusão placenta.

Resumo

Décadas atrás, a placenta humana foi pensado para ser uma barreira impenetrável entre a mãe eo feto. No entanto, a descoberta de defeitos congénitos, induzidos por talidomida e muitos estudos posteriores depois provado o oposto. Hoje vários xenobióticos nocivos, como nicotina, heroína, metadona ou drogas, bem como poluentes ambientais foram descritos para superar essa barreira. Com o crescente uso da nanotecnologia, a placenta é susceptível de entrar em contacto com novas nanopartículas seja acidental ou intencionalmente através da exposição no caso de potenciais aplicações nanomedical. Os dados de experiências em animais não podem ser extrapolados para seres humanos porque a placenta é o órgão mais específico da espécie de mamífero ^1. Portanto, o ex vivo dupla recirculação perfusão placentária humana, desenvolvido pela Panigel et ai. Em 1967 ² e continuamente modificado por Schneider et ai. Em 1972 ^3, pode servir como um excelente modelo tó estudar a transferência de partículas ou xenobióticos.

Aqui, vamos nos concentrar na dupla ex vivo recirculação protocolo de perfusão da placenta humana e seu desenvolvimento para obter resultados reproduzíveis.

O placentas foram obtidas após consentimento das mães de gestações complicadas prazo submetidas ao parto cesariana. Os vasos fetais e maternos de um dos cotilédones intactos foram canulados e perfundidos pelo menos por cinco horas. Como um modelo de partículas partículas de poliestireno marcadas com fluorescência, com tamanhos entre 80 e 500 nm de diâmetro foram adicionados ao circuito materna. As partículas de 80 nm eram capazes de atravessar a barreira placentária e proporcionar um perfeito exemplo para uma substância que é transferido através da placenta para o feto, enquanto as partículas de 500 nm foram retidos no tecido placentário ou circuito materna. O modelo de perfusão ex vivo da placenta humana é um dos poucos modelos que fornecem informações confiáveis ​​sobreo comportamento de transporte de xenobióticos em uma barreira importante tecido que proporciona dados relevantes preditivos e clínicas.

Introdução

A placenta é um órgão complexo que é responsável pela troca de oxigénio e dióxido de carbono, de nutrientes e de produtos de resíduos e, ao mesmo tempo capaz de manter os dois circuitos de sangue da mãe e para o feto em crescimento separados uns dos outros. Além disso, evita a rejeição da criança pelo sistema imune materno e segrega hormonas para manter a gravidez. A barreira celular é formada pelas células citotrofoblasto que fundem e formam uma verdadeira sincício sem membranas celulares laterais ^4,5. Toda a placenta é organizado em várias cotilédones, que contêm uma árvore vilosidades fetal e representam uma unidade funcional da placenta.

O estudo da função de barreira da placenta foi intensificada, com a descoberta dos malformações induzidas talidomida na década de 1960. Por razões óbvias, os estudos de translocação com mulheres grávidas não pode ser executada. Consequentemente, vários modelos alternativos foram desenvolvidos ^6,7 . O modelo relevante mais promissora, e provavelmente mais clínica é o modelo de perfusão ex-vivo de placenta humana desenvolvido por Panigel e colaboradores ^2,3.

Muitas mulheres estão expostas a diferentes xenobióticos, tais como drogas ou poluentes ambientais durante a gravidez ^8. Para alguns medicamentos, que já foram administradas regularmente durante a gravidez, em estudos in vivo, pode ser realizada por comparação da concentração de sangue materno com aquele no sangue do cordão umbilical. No entanto, geralmente há apenas informações limitadas sobre a farmacocinética e-dinâmica no feto e da teratogenicidade destas substâncias.

Por exemplo opiáceos como a heroína facilmente atravessar a barreira placentária e pode levar à restrição de crescimento intra-uterino, parto prematuro ou aborto espontâneo ^9,10. Assim, em caso de abstinência desaparecidos durante a gravidez recomenda-se uma terapia de substituição com metadona. O exmodelo de perfusão in vivo de placenta humana revelou que a transferência de metadona na circulação fetal é negligenciável ^11, o que se correlaciona bem com o sangue materno para cabo rácio de concentração no sangue calculados após entrega ^12.

A nanotecnologia é um campo em crescimento, especialmente em medicina. Assim, sob a natural fina (<2,5 m de diâmetro) e partículas ultrafinas (<0,1 m de diâmetro) em fumaça de incêndios florestais, erupções vulcânicas e poeira do deserto, a exposição a nanomateriais artificiais (pelo menos uma dimensão <0,1 mícron ¹³ ) está a aumentar. Isso levantou questões sobre o potencial toxicológico de nanomateriais. Apesar de não haver perigo humano poderia ser provado, no entanto, não são os principais estudos experimentais indicam que as nanopartículas de engenharia pode provocar respostas biológicas adversas que levam a resultados toxicológicos ^14. Recentemente, alguns estudos indicam que a exposição pré-natal aopoluição do ar está ligada a uma maior necessidade respiratório e inflamação das vias aéreas em recém-nascidos e crianças ^15,16. Além disso, pequenas nanopartículas podem ser utilizados como veículos de fármacos para tratar especificamente tanto o feto ou a mãe. Portanto, torna-se evidente que os estudos extensivos de xenobióticos distintos ou nanomateriais e sua capacidade de atravessar a barreira placentária são obrigatórios. Um panorama atual sobre os estudos atuais sobre a permeabilidade placentária para nanomateriais é resumido em Menezes et al. 2.011 ¹⁷ e Buerki-Thurnherr et al. 2.012 ^7.

A dupla ex vivo modelo de perfusão de recirculação de placenta humana proporciona um sistema fiável e controlada para o estudo do transporte placentário de vários compostos endógenos e exógenos ^{3,11,12,18,19} e uma ampla gama de outras funções da placenta como mecanismos responsáveis ​​pela desenvolvimento de estados patológicos como a pré-eclâmpsia ^{20-22. Neste protocolo, focadas principalmente no set up, manuseio e método que permitem o estudo de acumulação, os efeitos e as taxas de translocação de um amplo conjunto de xenobióticos ou nanopartículas.}

Protocolo

1. Preparação do sistema de perfusão

1. Configure o sistema de perfusão que consiste em um banho de água, uma câmara de perfusão, duas colunas para a oxigenação, duas bombas peristálticas, duas armadilhas bolha, dois geradores de fluxo e um sensor de pressão (Figura 1). Ligação desses componentes com as secções de tubagem composta de materiais de silicone e cloreto de polivinilo de acordo com o esquema da Figura 2. Finalmente, existem dois circuitos representando o circuito fetal e materna, respectivamente.
2. Ligue o banho de água, os aquecedores de fluxo eo aquecimento para a câmara de perfusão. A temperatura deve ser de 37 ° C.
3. Aquecer o meio de perfusão (NCTC-135 meio de cultura de tecidos diluídas 1:2 com tampão de Earle (6,8 g / L de cloreto de sódio, 0,4 g / L de cloreto de potássio, 0,14 g / L de fosfato monossódico, 0,2 g / L de sulfato de magnésio, 0,2 g / L de cloreto de cálcio, 2 g / L de glucose) suplementado com glucose (1 g / L), dextrano 40 (10 g / L), albumina do soro bovino (10 g/ L), heparina de sódio (2.500 UI / L), amoxicilina (250 mg / L) e bicarbonato de sódio (2,2 g / L), pH 7,4), em banho de água.
4. Consecutivamente enxaguar os sistemas arteriais de o circuito fetal e materno com um) 200 ml de água destilada, b) 50 mL de hidróxido de sódio a 1%, c) de 1% de ácido fosfórico e d) novamente 200 ml de água destilada (taxa de fluxo: 15 - 20 ml / min).
5. Ligue a cânula fetal (ø 1,2 mm; agulha romba deve ser anexado a um conjunto de infusão agulha alada modificada) para o tubo arterial fetal.
6. Enxaguar os sistemas arteriais de o circuito fetal e materno com um meio de perfusão até que todos os tubos contêm meio (caudal: 15-20 mL / min.) Durante esta etapa de encher os retentores de bolhas e remover todas as bolhas de jusante da armadilha. Em seguida, parar nas bombas. É muito importante que os tubos arteriais aferentes são sempre livre de bolhas, caso contrário, após punção especialmente os vasos fetais finas podem se romper.
7. Ligue o fluxo de gás. O circuito maternal é oxigenado wipo 5% de dióxido de carbono e 95% de ar sintético e o circuito fetal, com 5% de dióxido de carbono e 95% de azoto.
8. Iniciar a gravação do sensor de pressão.

2. Canulação da Placenta

1. Obter placentas intacto de gestações complicadas prazo após cesariana primária. Consentimento por escrito tem de ser dada (foi obtido no caso de nossos estudos) pelas mães antes do parto e que o estudo tem de ser aprovado pelo comitê de ética local (foi o caso em nossos estudos). Primeiro controle visual deve ser feito por parteiras para garantir uma placenta saudável e intacta.
2. Canulação da placenta é um passo crítico! Durante a perfusão a cada pequena ruptura no tecido pode conduzir a uma fuga entre a circulação materna e fetal. A placenta tem de ser obtida dentro de 30 min após o parto.
3. Seleccione um dos cotilédones intactos a zona marginal da placenta sem perturbações visíveis no lado materno. Na placa coriônica,amarrar ambos os ramos associados da artéria umbilical e veia a montante para o lado de punção mais tarde (em direção ao cordão umbilical) usando material de sutura cirúrgica. Faça sempre dois nós.
4. Canular a artéria fetal do primeiro. As artérias da placenta fetal são sempre menores e mais finas do que as veias.
5. Fazer uma sutura ao redor da artéria fetal, mas não amarrá-lo imediatamente. Mantenha o recipiente com uma pinça, corte o vaso com cuidado e colocar a pequena cânula (ø 1,2 mm) na artéria. Em seguida, amarre-se a sutura (dois nós).
6. Continuar com a veia fetal da mesma maneira, mas com um maior cânula (Ø 1,5-1,8 mm; agulha romba deve ser ligado a um conjunto de infusão de agulha com abas modificado).
7. Ligar a bomba fetal (2 mL / min.) Se não houver fugas e sangue visível emana da cânula da fetal, lentamente aumentar o fluxo de 4 ml / min. Observe a pressão na artéria fetal, não deve exceder os 70 mm Hg. Se o fluido vaza na fetal ou companheirornal cânula corrigi-los com outro sutura.
8. Coloque a placenta no suporte do tecido com o lado fetal e puxe a membrana placentária e tecido sobre os pontos. No final, o cotilédone perfundido deve estar no meio do furo no suporte do tecido.
9. Estabilizar a parte em que a membrana tem apenas a placenta com uma membrana de silicone (Ø 1 mm) ou, alternativamente, duas peças de parafilme.
10. Monte o suporte do tecido completo, aperte os parafusos e cortar o tecido pendendo. Por favor, note que o cânulas venosa e arterial não fiquem presos, mas em vez disso estava nos pequenos canais de suporte do tecido.
11. Gire o suporte do tecido de cabeça para baixo, colocá-lo na câmara de perfusão e adicionar a tampa. Agora, o lado materno deve estar no topo. Verifique sempre se o circuito fetal ainda está intacto eo meio está fluindo para fora do tubo de veia fetal.
12. Ligar a bomba materna (12 ml / min.) Introduzir os três contundente cânulas (Ø 0,8 mm) foi no the extremidade do tubo arterial materno para o espaço intervilositário penetrando a placa decidual. Para retornar o perfusato no circuito materna colocar um tubo de drenagem venosa, que também está ligado com a bomba materno para a posição mais baixa na parte superior da câmara de perfusão.
13. Ligação a cânula na veia fetal ao tubo veia fetal.

3. Executar o pré-and Experimental Fase de Perfusão

1. Para permitir que o tecido para se recuperar a partir do período isquémico após o parto e para expulsar o sangue no espaço intervilositário, uma abertura pré-fase de 20 minutos é necessária. Isso significa que a veia materna e fetal não estão levando de volta para o reservatório arterial contendo o meio de perfusão. Recolher o fluxo venoso fetal e materna em uma garrafa e descartá-lo após a pré-fase.
2. Para avaliar a integridade da perfusão realizar outra pré-fase de 20 minutos, mas em um circuito fechado. Usar dois reservatórios separados com o meio de perfusãopara o circuito fetal e maternal e fechar os circuitos, levando o fluxo venoso fetal de volta no reservatório fetal e maternal fluxo venoso de volta no reservatório maternal.
3. Para o experimento principal perfusão preparar dois frascos com 120 ml de meio de perfusão (um para a mãe e para o reservatório de um feto). Adicionar o radiomarcado ¹⁴ C-antipirina (4 nCi / ml, serve como controlo positivo; CUIDADO: substância radioactiva) e xenobióticos ou nanopartículas marcado por fluorescência que se pretende analisar para o reservatório materna. Misturar bem no perfusato materna.
4. Iniciar o experimento trocando o meio de perfusão puro com os dois balões preparados (reservatórios fetais e maternas). Feche os circuitos, levando o fetal venoso saída de volta no reservatório fetal e maternal fluxo venoso de volta no reservatório maternal.
5. Continuar a perfusão durante 6 horas e recolher amostras regularmente. Sempre ressuspender o meio no fetal e maternareservatório antes da retirada.
6. Controlar a pressão na artéria fetal (não deve exceder os 70 mm Hg), em ambos os circuitos de pH (deve estar numa gama fisiológica 7,2-7,4), e o volume de ambos os reservatórios (perda de volume do feto não deve ser superior a 4 ml / h) durante a perfusão . Se necessário ajustar o pH usando quer o ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.
7. Se a perda de volume no reservatório excede fetal de 4 ml / hr existe uma fuga no tecido e tem de se parar a perfusão. A taxa de perfusão durante 6 horas, sem vazamento de sucesso é de cerca de 15-20%.
8. Pare a perfusão após 6 horas. Apague as bombas, banhos de água, aquecedores de fluxo e fluxo de gás.
9. Retire a placenta do detentor do tecido, corte o cotilédones perfusão (mais brilhante do que o tecido não perfundidada) e pesá-lo.
10. Colher amostras de não perfundidada (parte da placenta que foi cortado no início, já poderia ser tomado durante a pré-fase) do tecido e perfusão (cada uma cerca de 1 g) e armazená-los a -20 ° Caté homogeneização ou em azoto líquido, para posterior análise. Fix outra amostra de tecido em formalina 4% para avaliação histopatológica. As amostras devem incluir todas as camadas da placenta.
11. Limpar os tubos após perfusão, por lavagem, sucessivamente, os sistemas arteriais de o circuito fetal e materno com um) 200 ml de água destilada, b) 50 mL de hidróxido de sódio a 1%, c) 50 ml de ácido fosfórico a 1% e d) novamente 200 ml de água destilada (caudal: 15-20 mL / min.)

O procedimento de funcionamento de todo o experimento perfusão placenta é ilustrado na Figura 3.

4. Analisando as amostras

1. Centrifugar as amostras de perfusato durante 10 minutos a 800 xg antes da análise para remover os eritrócitos residuais. Leve o sobrenadante para a análise posterior. As amostras podem ser deixadas durante a noite a 4 ° C. Para a análise da produção de hCG, a leptina e as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C.
2. Para avaliar a permeabilidade daplacenta analisar o C-antipirina ¹⁴ por cintilação líquida. Misturar 300 ul das amostras fetais e maternas com 3 ml de cocktail de cintilação e medida durante 5 minutos num contador beta.
3. Para avaliar a transferência das nanopartículas fluorescentes ou xenobióticos de interesse ler a fluorescência a 485 nm de excitação e de emissão de 528 nm em um leitor de microplacas (comprimentos de onda são indicadas para a análise do rótulo verde amarelo que foi usado para as nanopartículas).
4. Para determinar a viabilidade do tecido placentário durante a perfusão medida do consumo de glucose e produção de lactato no circuito fetal e materno com um sistema automático de gás do sangue. Além disso, avaliar a produção das hormonas choriongonadotropin placentária humana (hCG) e leptina nas amostras de tecido homogeneizado e os perfusatos por ensaio imunoenzimático (ELISA).

Resultados

A figura 4A mostra os perfis de perfusão de pequenas partículas de poliestireno (80 nm), que foram transportados através da placenta maiores em comparação com partículas de poliestireno (500 nm), que não foram transferidos para o compartimento fetal. Cada ponto de dados representa a concentração média de partícula para um determinado ponto de pelo menos 3 experiências independentes do tempo. Para poliestireno nanopartículas a transferência placentária é dependente do tamanho ^19.

Discussão

Sob a perfusão de recirculação dupla mostrou aqui, existem várias outras configurações experimentais possíveis, dependendo da questão que tem de ser respondida. Perfusões placentários Particularmente abertos são usados ​​para avaliar a depuração da droga a uma concentração de estado estacionário ^3. A perfusão de recirculação set-up também pode ser aplicado para confirmar o transporte ativo de substâncias endógenas ou exógenas. Por esta abordagem, a mesma concentração do xenobióti...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCTC-135 medium	ICN Biomedicals, Inc.	10-911-22C	could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769)
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich, Fluka	71381
Potassium chloride (KCl)	Hospital pharmacy		also possible: Sigma (P9541)
Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O)	Merck	106346
Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O)	Sigma-Aldrich, Fluka	63139
Calcium chloride (CaCl, anhydrous)	Merck	102388
D(+) Glucose (anhydrous)	Sigma-Aldrich, Fluka	49138
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck	106329
Dextran from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	31389
Bovine serum albumin (BSA)	Applichem	A1391
Amoxicilline (Clamoxyl)	GlaxoSmithKline AG	2021101A
Sodium heparin	B. Braun Medical AG	3511014
Sodium hydoxide (NaOH) pellets	Merck	106498	CAUTION: corrosive
Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4)	Merck	100573	CAUTION: corrosive
Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2	PanGas AG
Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2	PanGas AG
Antipyrine (N-methyl-14C)	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ARC 0108-50 μCi	CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol)
Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus)	Zinsser Analytic GmbH	1003100
Polystyrene particles 80 nm	Polyscience, Inc.	17150
Polystyrene particles 500 nm	Polyscience, Inc.	17152
EQUIPMENT
Water bath	VWR	462-7001
Thermostat	IKA-Werke GmbH Co. KG	3164000
Peristaltic pumps	Ismatec	ISM 833
Bubble traps (glass)	UNI-GLAS Laborbedarf
Flow heater	UNI-GLAS Laborbedarf
Pressure sensor + Software for analyses	MSR Electronics GmbH	145B5
Notebook	Hewlett Packard
Miniature gas exchange oxygenator	Living Systems Instrumentation	LSI-OXR
Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm)	Ismatec	MF0028
Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm)	Ismatec	SC0744
Blunt cannulae ( 0.8 mm)	Polymed Medical Center	03.592.81
Blunt cannulae ( 1.2 mm)	Polymed Medical Center	03.592.90
Blunt cannulae ( 1.5 mm)	Polymed Medical Center	03.592.94
Blunt cannulae ( 1.8 mm)	Polymed Medical Center	03.952.82
Parafilm	VWR	291-1212
Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass)	Internal technical department		Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK
Surgical suture material (PremiCron)	B. Braun Medical AG	C0026005
Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly)	Hospira, Inc.	ASN 2102
Multidirectional stopcock (Discofix C-3)	B. Braun Medical AG	16494C
Surgical scissors	B. Braun Medical AG	BC304R
Dissecting scissors	B. Braun Medical AG	BC162R
Needle holder	B. Braun Medical AG	BM200R
Dissecting forceps	B. Braun Medical AG	BD215R
Automated blood gas system	Radiometer Medical ApS	ABL800 FLEX
Multi-mode microplate reader	BioTek	Synergy HT
Liquid scintillation analyzer	GMI, Inc.	Packard Tri-Carb 2200
Scintillation tubes 5.5 ml	Zinsser Analytic GmbH	3020001
Tissue Homogenizer	OMNI, Inc.	TH-220
pH meter + electrode	VWR	662-2779