Bestimmung der Transport von Xenobiotika und Nanomaterialien über die Plazenta mit dem<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menschliche Plazentaperfusion Modell

Zusammenfassung

Die Ex vivo Dual rezirkulierenden menschlichen Plazentaperfusion Modell kann verwendet werden, um die Übertragung von Xenobiotika und Nanopartikel in der menschlichen Plazenta zu untersuchen. In diesem Video-Protokoll beschreiben wir die Ausrüstung und Techniken für eine erfolgreiche Durchführung einer Plazenta Perfusion erforderlich.

Zusammenfassung

Vor Jahrzehnten der menschlichen Plazenta wurde gedacht, um eine undurchdringliche Barriere zwischen Mutter und das ungeborene Kind. Allerdings ist die Entdeckung von Thalidomid-induzierten Missbildungen und viele spätere Studien danach bewies das Gegenteil. Heute mehreren schädlichen Fremdstoffen wie Nikotin, wurden Heroin, Methadon oder Drogen sowie Umweltschadstoffe beschrieben, diese Barriere zu überwinden. Mit dem zunehmenden Einsatz von Nanotechnologie ist die Plazenta wahrscheinlich in Kontakt mit neuartigen Nanopartikel kommen entweder versehentlich oder absichtlich durch ein Engagement im Falle von potentiellen Nanomedizin. Daten aus Tierversuchen nicht auf den Menschen übertragen werden, da die Plazenta ist die Spezies-spezifische Säugetierorgans ^1. Daher ist die ex vivo Dual Umluftbetrieb menschlichen Plazentaperfusion durch Panigel et al. ² und 1967 kontinuierlich von Schneider et al modifiziert. ³ im Jahr 1972, als ein hervorragendes Modell t dienenO Studie die Übertragung von Fremdstoffen oder Partikel.

Hier konzentrieren wir uns auf die ex vivo Dual Umluftbetrieb menschlichen Plazentaperfusion Protokoll und seine Weiterentwicklung, um reproduzierbare Ergebnisse zu erwerben konzentrieren.

Die Plazenten wurden nach Einwilligung der Mütter von einer unkomplizierten Schwangerschaften Kaiserschnitt unterzogen Lieferung erhalten. Die fetalen und mütterlichen Gefäße eines intakten cotyledon wurden durchbohrt und mindestens fünf Stunden perfundiert. Als Modell Partikel fluoreszenzmarkierten Polystyrol-Partikel mit Größen von 80 und 500 nm Durchmesser wurden in den mütterlichen Kreislauf aufgenommen. Die 80 nm-Partikel konnten die Plazentaschranke und bieten ein perfektes Beispiel für eine Substanz, die über die Plazenta auf den Fötus übertragen werden, während die 500 nm Partikel in der Plazentagewebe oder mütterlichen Kreislauf gehalten wurden. Die ex vivo menschlichen Plazentaperfusion Modell ist eines der wenigen Modelle, die zuverlässige Informationen überdas Verkehrsverhalten von Fremdstoffen an einem wichtigen Gewebe Barriere, die vorausschauende und klinisch relevante Daten liefert.

Einleitung

Die Plazenta ist ein komplexes Organ, das für den Austausch von Sauerstoff, Kohlendioxid, Nährstoffen und Abfallprodukten und gleichzeitig in der Lage, die beiden Schaltungen Blut der Mutter und den wachsenden Fötus voneinander getrennt zu halten. Außerdem verhindert es die Ablehnung des Kindes durch das mütterliche Immunsystem und Hormone absondert, um eine Schwangerschaft zu erhalten. Die zelluläre Barriere wird durch die Zytotrophoblastzellen die verschmelzen und bilden eine echte Synzytium ohne seitliche Zellmembranen ^4,5 gebildet. Die ganze Plazenta in mehrere Keimblätter, die fetale villous Baum enthalten und stellen eine funktionelle Einheit der Plazenta organisiert.

Die Untersuchung der Plazenta-Funktion wurde mit der Entdeckung der Thalidomid Fehlbildungen induziert in den 1960er Jahren intensiviert. Aus offensichtlichen Gründen Translokation Studien mit schwangeren Frauen können nicht durchgeführt werden. Folglich wurden verschiedene alternative Modelle entwickelt ^6,7 . Die vielversprechendste und wahrscheinlich klinisch relevanten Modell ist die ex vivo menschlichen Plazentaperfusion Modell Panigel und Mitarbeiter ^2,3 entwickelt.

Viele Frauen sind auf verschiedene Xenobiotika wie Drogen oder Umweltgiften während ihrer Schwangerschaft ⁸ ausgesetzt. Bei einigen Arzneimitteln, die bereits verabreicht wurden regelmäßig während der Schwangerschaft, kann in vivo Studien durch Vergleich der mütterlichen Blutkonzentration mit der in Nabelschnurblut durchgeführt werden. Allerdings, in der Regel gibt es nur begrenzte Informationen über die Pharmakokinetik und-dynamik in den Fötus und das Teratogenität dieser Stoffe.

Zum Beispiel Opiate wie Heroin leicht die Plazentaschranke und kann auf intrauterine Wachstumsretardierung, Frühgeburt oder Fehlgeburt ^9,10 führen. Also, bei fehlender Abstinenz während der Schwangerschaft eine Substitutionstherapie mit Methadon wird empfohlen. Der Exvivo menschlichen Plazentaperfusion Modell zeigte, dass die Übertragung von Methadon in den fetalen Kreislauf vernachlässigbar ^11, die korreliert gut mit dem berechneten Nabelschnurblut-to-mütterlichen Blut Konzentrationsverhältnis nach der Lieferung der ^12.

Nanotechnologie ist ein wachsendes Feld vor allem in der Medizin. Also, unter dem natürlich vorkommenden feinen (<2,5 &mgr; m im Durchmesser) und ultrafeine Partikel (<0,1 &mgr; m im Durchmesser) in Rauch der Waldbrände, Vulkanausbrüche und in der Wüste Staub, die Exposition gegenüber Nanomaterialien (mindestens einer Dimension <0,1 um ¹³ ) steigt. Dies warf Fragen über die toxikologischen Potential Nanomaterialien. Obwohl kein Mensch Gefahr noch nachgewiesen werden konnte, gibt es Haupt-experimentelle Studien darauf hinweist, dass Nanopartikel können schädliche biologische Reaktionen, die zu toxikologischen Ergebnisse ¹⁴ verursachen. Kürzlich gaben einige Studien, dass pränataleLuftverschmutzung auf einen höheren Bedarf Atemwege und Entzündung der Atemwege bei Neugeborenen und Kinder ^15,16 verbunden. Darüber hinaus können kleine Nanopartikel als Drug-Carrier verwendet werden, um speziell zu behandeln entweder den Fötus oder die Mutter. Daher wird es offensichtlich, dass umfangreiche Untersuchungen verschiedener Xenobiotika oder Nanomaterialien und deren Fähigkeit, die Plazentaschranke erforderlich sind. Eine aktuelle Übersicht über die aktuellen Studien auf Plazentagängigkeit zu Nanomaterialien in Menezes et al zusammengefasst. 2011 ¹⁷ und Buerki-Thurnherr et al. 2012 ^7.

Die ex vivo Dual Umluftbetrieb menschlichen Plazentaperfusion Modell bietet eine kontrollierte und zuverlässiges System für die Untersuchung der Plazenta Transport verschiedener endogener und exogener Verbindungen ^{3,11,12,18,19} und eine breite Palette von anderen Funktionen der Plazenta wie Mechanismen, die für die Entwicklung von pathologischen Zuständen wie Präeklampsie ^{20-22. In diesem Protokoll haben wir vor allem auf dem Aufbau, Handhabung und Verfahren, die das Studium der Akkumulation, Effekte und Translokation Preise einer breiten Palette von Fremdstoffen oder Nanopartikeln erlauben.}

Protokoll

1. Vorbereiten der Perfusion Systems

1. Richten Sie die Perfusion System, bestehend aus einem Wasserbad, ein Perfusionskammer, zwei Spalten für Sauerstoffversorgung, zwei Schlauchpumpen, zwei Blasenfallen, zwei Durchlauferhitzern und einem Drucksensor (Abbildung 1). Verbinden dieser Komponenten mit Rohrabschnitte aus Silikon und Polyvinylchlorid-Materialien nach dem Schema in Fig. 2 aufgebaut. Schließlich gibt es zwei Schaltungen, die die Mutter und Kind-Schaltung sind.
2. Schalten Sie auf dem Wasserbad, den Durchlauferhitzer und die Heizung für die Perfusionskammer. Die Temperatur sollte 37 ° C sein
3. Aufwärmen des Perfusionsmedium (NCTC-135 Zellkulturmedium verdünnt 1:2 mit Earle-Puffer (6,8 g / L Natriumchlorid 0,4 g / L Kaliumchlorid, 0,14 g / l Mononatriumphosphat, 0,2 g / L Magnesiumsulfat, 0,2 g / l Calciumchlorid, 2 g / l Glucose) mit Glukose (1 g / L), Dextran 40 (10 g / L), Rinderserumalbumin (10 g ergänzt/ L), Heparin-Natrium (2.500 IU / L), Amoxicillin (250 mg / L) und Natriumbicarbonat (2,2 g / l), pH 7,4) in dem Wasserbad.
4. Nachfolgend spülen die arteriellen Systeme des fetalen und mütterlichen Kreislauf mit a) 200 ml destilliertem Wasser, b) 50 ml 1% iger Natronlauge, c) 1% Phosphorsäure und d) wieder 200 ml destilliertem Wasser (Flussrate: 15 - 20 ml / min).
5. Schließen Sie das fetale Kanüle (Ø 1,2 mm; stumpfe Nadel sollte auf einer modifizierten Flügelkanüle Infusionsset befestigt werden), um die fetale arterielle Schlauch.
6. Spülen Sie die arteriellen Systeme des fetalen und mütterlichen Kreislauf mit Perfusionsmedium bis alle Rohre Medium (Durchfluss: 15-20 ml / min) enthalten. In diesem Schritt füllen die Blasenfallen und entfernen Sie alle Blasen hinter dem Ableiter. Dann stoppen die Pumpen. Es ist wirklich wichtig, dass die zuführenden Arterien Rohre stets frei von Blasen, sonst nach Kanülierung besonders die feinen Gefäße fetalen reißen können.
7. Schalten Sie den Gasstrom. Die mütterliche Schaltung wird mit Sauerstoff angereichert with 5% Kohlendioxid und 95% synthetischer Luft und die fetale Schaltung mit 5% Kohlendioxid und 95% Stickstoff.
8. Start der Aufnahme des Drucksensors.

2. Kanülieren die Placenta

1. Erhalten intakt placentae von einer unkomplizierten Schwangerschaften nach der primären Kaiserschnitt. Die schriftliche Zustimmung gegeben hat (wurde im Falle unserer Studien erhalten) von den Müttern werden vor der Auslieferung und die Studie hat die von der lokalen Ethikkommission genehmigt werden (war der Fall in unsere Studien). Erste visuelle Kontrolle sollte von Hebammen durchgeführt werden, um eine gesunde und intakte Plazenta versichern.
2. Kanülierung der Plazenta ist ein wichtiger Schritt! Während jede kleine Störung Perfusion des Gewebes kann zu einem Leck zwischen dem mütterlichen und fetalen Kreislauf führen. Die Plazenta ist innerhalb von 30 min nach der Lieferung erhalten werden.
3. Wählen Sie eine intakte cotyledon an der Randzone der Plazenta ohne sichtbare Störungen auf der mütterlichen Seite. Am Chorionplatte,binden beide verbundenen Zweige der Nabelschnur Arterie und Vene oberhalb des späteren Kanülierung Seite (in Richtung der Nabelschnur) mit chirurgischem Nahtmaterial. Machen Sie immer zwei Knoten.
4. Kanülieren der fetalen Arteria erste. Die fetale Plazenta Arterien sind immer kleiner und dünner als die Venen.
5. Machen Sie eine Naht um die fetale Arterie, sondern binden Sie es nicht sofort. Halten Sie das Gefäß mit einer Pinzette, schneiden Sie das Gefäß sorgfältig und setzen Sie den kleinen Kanüle (Ø 1,2 mm) in der Arterie. Dann binden Sie die Naht (zwei Knoten).
6. Fahren Sie mit dem fetalen Vene in der gleichen Weise, sondern verwenden eine größere Kanüle (Ø 1,5-1,8 mm; stumpfe Nadel sollte auf einer modifizierten Flügelkanüle Infusionsset befestigt werden).
7. Schalten der fetalen Pumpe (2 ml / min). Wenn es kein sichtbares Leck und Blut ausströmt aus dem fetalen Venenkanüle, langsam erhöhen den Fluss bis zu 4 ml / min. Beobachten des Drucks in der fetalen Arteria Wert nicht mehr als 70 mmHg. Wenn Lecks bei der fetalen oder Maternal Kanüle befestigen Sie sie mit einem anderen Faden.
8. Legen Sie die Plazenta auf das Gewebe Halter mit der fetalen Seite nach oben und ziehen Sie den Plazenta-Membran und Gewebe über die Spikes. Am Ende der perfundierten cotyledon sollte in der Mitte des Loches in dem Papierrollenhalter sein.
9. Stabilisieren Sie den Teil, wo nur die Membran hält die Plazenta mit einem Silikon-Membran (Ø 1 mm) oder alternativ zwei Parafilm Stücke.
10. Montieren Sie das komplette Gewebe Halter, die Schrauben festziehen und schneiden Sie die überstehenden Gewebes. Bitte beachten Sie, dass der venösen und arteriellen Kanülen nicht eingeklemmt, sondern lag in den kleinen Kanälen des Gewebes Inhaber.
11. Drehen Sie den Papierrollenhalter den Kopf, steckte es in den Perfusionskammer und fügen Sie den Deckel. Jetzt sollte der mütterlichen Seite an der Spitze sein. Überprüfen Sie immer, wenn die fetalen Kreislauf noch intakt ist und das Medium strömt aus dem fetalen Venenschlauchset.
12. Drehen der mütterlichen Pumpe (12 ml / min). Führen Sie die drei stumpfen Kanülen (Ø 0,8 mm) an der THe Ende des mütterlichen Arterie Rohr in die intervillösen Raum durch Eindringen der dezidualen Platte. Um das Perfusat dem mütterlichen Kreislauf zurück legte eine Röhre venösen Abfluss, der auch mit dem mütterlichen Pumpe in die unterste Position im oberen Teil der Kammer Perfusion angeschlossen.
13. Schließen Sie das fetale Venenkanüle der fetalen Vene Rohr.

3. Ausführen des Pre-und Experimentelle Phase der Perfusion

1. Damit die Gewebe aus dem ischämischen Periode nach der Entbindung zu erholen und zu spülen, das Blut im intervillösen Raum, ist eine offene Vorphase von 20 min notwendig. Das bedeutet, dass die mütterlichen und fetalen Vene führen nicht zurück in die arteriellen Reservoir, das die Perfusionsmedium. Sammeln Sie die fötalen und mütterlichen venösen Abfluss in einer Flasche und entsorgen Sie sie nach der Pre-Phase.
2. Um die Integrität der Perfusion beurteilen erneut eine Vorphase von 20 min, jedoch in einem geschlossenen Kreislauf. Mit zwei getrennten Behältern mit Perfusionsmediumfür die fetale und mütterliche Schaltung und schließen Sie die Schaltungen von führenden der fetalen venösen Abfluss zurück in der fetalen Reservoir und der mütterlichen venösen Abfluss zurück in die mütterliche Reservoir.
3. Für die Haupt-Perfusion Experiment vorbereitet zwei Kolben mit 120 ml Perfusionsmedium (eine für die Mutter und eine für die fötale Reservoir). Fügen Sie den radioaktiv markierten ¹⁴ C-Antipyrin (4 nCi / ml; dient als positive Kontrolle; ACHTUNG: radioaktive Substanz) und die fluoreszenzmarkierten xenobiotischen oder Nanopartikel, die man will, um die mütterliche Reservoir zu analysieren. Mischen Sie die mütterliche Perfusat gut.
4. Starten Sie das Experiment durch Austausch der reinen Perfusionsmedium mit den beiden vorbereiteten Kolben (fetale und mütterliche Stauseen). Schließen Sie die Schaltungen von führenden der fetalen venösen Abfluss zurück in der fetalen Reservoir und den mütterlichen venösen Abfluss zurück in die mütterliche Reservoir.
5. Fahren Sie mit der Perfusion für 6 Stunden und nehmen regelmäßig Proben. Immer resuspendieren das Medium in der fetalen und mütterlichenReservoir vor der Entnahme.
6. Kontrollieren Sie den Druck in der fetalen Arteria (sollte nicht mehr als 70 mmHg), pH-Wert in beiden Kreisen (sollte in einem physiologischen Bereich 7,2-7,4 sein) und das Volumen der beiden Stauseen (fetale Volumenverlust sollte nicht mehr als 4 ml / h) während der Perfusion . Wenn notwendig, den pH-Werten unter Verwendung von entweder Salzsäure oder Natriumhydroxid.
7. Wenn der Volumenverlust in der fetalen Reservoir übersteigt 4 ml / h gibt es ein Leck in das Gewebe, und man muss die Durchblutung zu stoppen. Die Erfolgsrate einer Perfusion für 6 Stunden ohne Leck ist etwa 15-20%.
8. Stoppen Sie die Perfusion nach 6 Stunden. Drehen Sie die Pumpen, Wasserbad, Durchlauferhitzer und Gasstrom.
9. Entfernen Sie die Plazenta von der Gewebe-Halter, schneiden Sie den durchbluteten cotyledon (heller als die unperfused Gewebe) und gewogen.
10. Nehmen Sie Proben von unperfused (Teil der Plazenta, die am Anfang abgeschnitten wurde; konnte bereits während der Pre-Phase) entnommen und durchbluteten Gewebe (je ca. 1 g) und speichert sie bei -20 ° Cbis zur Homogenisierung oder in flüssigem Stickstoff für eine spätere Analyse. Fix noch Gewebeprobe in 4% Formalin zur histopathologischen Auswertung. Die Proben sollten alle Schichten der Plazenta.
11. Reinigen der Rohre nach Perfusion durch sukzessives Spülen der arteriellen System des fötalen und mütterlichen Kreislauf mit a) 200 ml destilliertes Wasser, b) 50 ml 1%-iger Natronlauge, c) 50 ml 1% iger Phosphorsäure und d) erneut 200 ml destilliertem Wasser (flow: 15-20 ml / min).

Der gesamte Arbeitsablauf der Plazenta Perfusion ist in Abbildung 3 dargestellt.

4. Die Analyse der Proben

1. Zentrifugieren Sie die Proben Perfusat für 10 min bei 800 xg vor der Analyse restliche Erythrozyten zu entfernen. Nehmen Sie den Überstand für die weitere Analyse. Die Proben können über Nacht bei 4 ° C belassen werden Für die Analyse von Leptin und hCG-Produktion können die Proben bei -20 ° C gelagert werden
2. Um die Durchlässigkeit der AuswertungsPlazenta analysieren die ¹⁴ C-Antipyrin durch Flüssigszintillationszählung. Mischen Sie 300 ul der fetalen und mütterlichen Proben mit 3 ml Szintillationscocktail und Maß für 5 min in einer Beta-Zähler.
3. Um die Übertragung der fluoreszierenden Nanopartikel oder die xenobiotischen von Interesse lesen Sie die Fluoreszenz bei 485 nm Anregung und 528 nm Emission in einem Mikroplatten-Reader (angezeigt Wellenlängen sind für die Analyse der gelb green label, die wir für die Nanopartikel verwendet) zu beurteilen.
4. Um die Lebensfähigkeit des Plazentagewebe während der Perfusion messen die Glukose Verbrauch und Laktat-Produktion in der fetalen und mütterlichen Kreislauf mit einem automatisierten Blutgassystems bestimmen. Zudem untersuchen die Produktion des Plazentahormone menschlichen Choriongonadotropin (hCG) und Leptin in die homogenisierte Gewebeproben und die Perfusaten durch Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Ergebnisse

4A zeigt die Perfusion Profile kleiner Polystyrol-Partikel (80 nm), die über die Plazenta im Vergleich zu größeren Teilchen Polystyrol (500 nm), die nicht an der fetalen Kompartiment übertragen wurden transportiert. Jeder Datenpunkt repräsentiert den Mittelwert Partikelkonzentration zu dem gegebenen Zeitpunkt von mindestens 3 unabhängigen Experimenten. Für Polystyrol-Nanopartikel die Plazenta Übertragung größenabhängigen ^19. Nach 3 h Plazenta Perfusion bereits 20-30% der ursprüngl...

Diskussion

Unter dem Dual Umluftbetrieb Perfusion zeigte hier, gibt es mehrere andere experimentelle Konfigurationen möglich, abhängig von der Frage, die beantwortet werden muss. Besonders offen Plazenta Infusionen werden häufig verwendet, um die Arzneimittel-Clearance im Steady-State-Konzentration ³ zu beurteilen. Die Rückführung Perfusion Set-up kann auch angewendet werden, um den aktiven Transport von endogenen oder exogenen Substanzen zu bestätigen. Für diesen Ansatz die gleiche Konzentration des xenobiotisch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCTC-135 medium	ICN Biomedicals, Inc.	10-911-22C	could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769)
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich, Fluka	71381
Potassium chloride (KCl)	Hospital pharmacy		also possible: Sigma (P9541)
Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O)	Merck	106346
Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O)	Sigma-Aldrich, Fluka	63139
Calcium chloride (CaCl, anhydrous)	Merck	102388
D(+) Glucose (anhydrous)	Sigma-Aldrich, Fluka	49138
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck	106329
Dextran from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	31389
Bovine serum albumin (BSA)	Applichem	A1391
Amoxicilline (Clamoxyl)	GlaxoSmithKline AG	2021101A
Sodium heparin	B. Braun Medical AG	3511014
Sodium hydoxide (NaOH) pellets	Merck	106498	CAUTION: corrosive
Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4)	Merck	100573	CAUTION: corrosive
Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2	PanGas AG
Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2	PanGas AG
Antipyrine (N-methyl-14C)	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ARC 0108-50 μCi	CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol)
Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus)	Zinsser Analytic GmbH	1003100
Polystyrene particles 80 nm	Polyscience, Inc.	17150
Polystyrene particles 500 nm	Polyscience, Inc.	17152
EQUIPMENT
Water bath	VWR	462-7001
Thermostat	IKA-Werke GmbH Co. KG	3164000
Peristaltic pumps	Ismatec	ISM 833
Bubble traps (glass)	UNI-GLAS Laborbedarf
Flow heater	UNI-GLAS Laborbedarf
Pressure sensor + Software for analyses	MSR Electronics GmbH	145B5
Notebook	Hewlett Packard
Miniature gas exchange oxygenator	Living Systems Instrumentation	LSI-OXR
Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm)	Ismatec	MF0028
Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm)	Ismatec	SC0744
Blunt cannulae ( 0.8 mm)	Polymed Medical Center	03.592.81
Blunt cannulae ( 1.2 mm)	Polymed Medical Center	03.592.90
Blunt cannulae ( 1.5 mm)	Polymed Medical Center	03.592.94
Blunt cannulae ( 1.8 mm)	Polymed Medical Center	03.952.82
Parafilm	VWR	291-1212
Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass)	Internal technical department		Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK
Surgical suture material (PremiCron)	B. Braun Medical AG	C0026005
Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly)	Hospira, Inc.	ASN 2102
Multidirectional stopcock (Discofix C-3)	B. Braun Medical AG	16494C
Surgical scissors	B. Braun Medical AG	BC304R
Dissecting scissors	B. Braun Medical AG	BC162R
Needle holder	B. Braun Medical AG	BM200R
Dissecting forceps	B. Braun Medical AG	BD215R
Automated blood gas system	Radiometer Medical ApS	ABL800 FLEX
Multi-mode microplate reader	BioTek	Synergy HT
Liquid scintillation analyzer	GMI, Inc.	Packard Tri-Carb 2200
Scintillation tubes 5.5 ml	Zinsser Analytic GmbH	3020001
Tissue Homogenizer	OMNI, Inc.	TH-220
pH meter + electrode	VWR	662-2779