קביעת תעריף הובלת xenobiotics ו ננו מעבר לשליה באמצעות<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; דגם זלוף שליה אנושי

Summary

לשעבר vivo מודל זלוף שליה אנושי הסירקולציה המחודשת כפול יכול לשמש כדי לחקור את העברת xenobiotics ו חלקיקים ברחבי שליית האדם. בפרוטוקול וידאו זה אנו מתארים את הציוד וטכניקות הנדרשות לביצוע מוצלח של זלוף שליה.

Abstract

לפני עשרות שנים שליית האדם נחשב מחסום בלתי חדיר בין האם והעובר. עם זאת, הגילוי של מומים מולדים-Induced תלידומיד ומחקרים רבים מאוחר יותר לאחר מכן הוכיח את ההפך. היום כמה xenobiotics מזיק כמו ניקוטין, הרואין, מתדון או תרופות, כמו גם מזהמים סביבתיים תואר להתגבר על המכשול הזה. עם השימוש הגובר של ננוטכנולוגיה, השלייה עשויה לבוא במגע עם חלקיקי רומן או בטעות או במכוון באמצעות חשיפה במקרה של יישומי nanomedical פוטנציאליים. נתונים מניסויים בבעלי החיים לא ניתן להסיק לבני אדם, כי השליה היא האיבר של היונקים מינים הספציפיים ביותר ^1. לכן, vivo לשעבר זלוף שליה אנושי הסירקולציה המחודשת כפול, שפותח על ידי Panigel et al. בשינה 1967 ² ורציפות שונה על ידי שניידר ואח'. בשנת 1972 ^3, יכול לשמש כמודל לא מצויןo ללמוד את העברת xenobiotics או חלקיקים.

כאן, אנו מתמקדים כפול vivo לשעבר הסירקולציה המחודשת פרוטוקול זלוף שליה אנושי ופיתוח נוסף שלה לרכישת תוצאות לשחזור.

Placentae התקבלו לאחר הסכמה מדעת מהאמהות מהריונות טווח מסובכים שעברו לידה בניתוח קיסרית. כלי העובריים ואימהיים של טבורית השלמה היו cannulated וperfused לפחות במשך חמש שעות. כמודל חלקיקי חלקיקי פוליסטירן שכותרתו fluorescently עם גדלים של 80 ו -500 ננומטר בקוטר נוספו למעגל האימהי. ה -80 ננומטר החלקיקים הצליחו לחצות את מחסום השליה ולספק דוגמה מושלמת לחומר אשר מועבר על פני השליה לעובר ואילו 500 ננומטר החלקיקים נשמרו ברקמת השליה או מעגל אימהי. מודל זלוף השליה לשעבר vivo האנושי הוא אחד מכמה מודלים המספקים מידע אמין עלהתנהגות ההובלה של xenobiotics במחסום רקמה חשוב, אשר מספק נתונים רלוונטיים לניבוי וקליניים.

Introduction

השליה היא איבר מורכב האחראית על חילופי חמצן, פחמן דו חמצני, חומרים מזינים וחומרי פסולת ובו בזמן מסוגל לשמור על שני המעגלים של האם והעובר הגדל מופרד אחד מהשני בדם. בנוסף, הוא מונע דחייה של הילד על ידי מערכת החיסון האימהית ומפריש הורמונים כדי לשמור על הריון. המכשול הסלולרי נוצר על ידי תאי cytotrophoblast שהפתיל וליצור syncytium אמיתי בלי קרום תא לרוחב ^4,5. כל השליה מאורגנת בכמה פסיגים, המכילים עץ אחד villous עוברי ומייצגים יחידה תפקודית אחת מהשליה.

המחקר של תפקוד מחסום השליה הוגבר עם הגילוי של מומים המושרה התלידומיד בשנתי ה -1960. מסיבות מובנות לא ניתן לבצע מחקרי טרנסלוקציה עם נשים בהריון. כתוצאה מכך, מודלים חלופיים שונים פותחו ^6,7 . המודל הרלוונטי המבטיח ביותר וכנראה הקליני ביותר הוא מודל vivo לשעבר אנושי השליה זלוף שפותח על ידי Panigel ועמיתים לעבודה ^2,3.

נשים רבות נחשפות לxenobiotics שונה כגון תרופות או מזהמים סביבתיים במהלך ההריון שלהם ^8. לחלק מתרופות שכבר מנוהלות באופן קבוע במהלך הריון, במחקרי vivo יכול להתבצע על ידי השוואה של ריכוז הדם האימהי עם זה בדם של חבל טבור. עם זאת, בדרך כלל יש מידע מוגבל בלבד על הפרמקוקינטיקה ו- דינמיקה בעובר וteratogenicity של חומרים אלה.

לדוגמא אופיאטים כמו הרואין לחצות בקלות את מחסום השליה ויכול להוביל להגבלת צמיחה תוך רחמי, לידה מוקדמת או הפלה ספונטנית ^9,10. לכן, במקרה של התנזרות חסרה בזמן הריון טיפול בתחליפי מתדון עם מומלץ. לשעברמודל זלוף שליה אנושי vivo חשף כי העברת מתדון למחזור הדם של העובר היא ¹¹ זניחים, שקושר היטב עם הדם האימהי ליחס מחושב דם טבורי הריכוז לאחר לידת ^12.

הננוטכנולוגיה היא תחום צומח ובמיוחד בתחום הרפואה. לכן, באופן טבעי מתחת לקנס (<2.5 מיקרומטר קוטר) וחלקיקי ultrafine (<0.1 מיקרומטר קוטר) בעשן של שריפות יער, התפרצויות הרי געש ואבק במדבר, החשיפה לננו מהונדס (ממד אחד לפחות <0.1 מיקרומטר ¹³ ) הולך וגדל. זה העלה שאלות לגבי הפוטנציאל של ננו טוקסיקולוגי מהונדס. למרות שאין סכנה לבני אדם ניתן יהיה להוכיח זאת, יש מחקרים ניסיוניים עיקריים מצביעים על כך שחלקיקים מהונדסים יכולים לגרום לתגובות ביולוגיות שליליות מובילות לתוצאות toxicological ^14. לאחרונה, חלק מהמחקרים מצביעים על כך שחשיפה טרום לידתי כדיזיהום אוויר קשור לצורך גבוה יותר בדרכי הנשימה ודלקת בדרכי נשימה בתינוקות ובילדים ^15,16. בנוסף, חלקיקים קטנים עשויים לשמש כנשאים תרופות לטיפול או לעובר או לאם באופן ספציפי. לכן, הוא הופך להיות ברור כי מחקרים מקיפים של xenobiotics או ננו שונים וביכולתם לחצות את מחסום השליה נדרשים. סקירה בפועל על המחקרים השוטפים על חדירות שליה לננו המהונדסים מסוכמים במנזס et al. 2011 ¹⁷ וBuerki-Thurnherr et al. 2012 ^7.

הכפול vivo לשעבר הסירקולציה המחודשת מודל זלוף שליה אנושי מספק מערכת מבוקרת ואמינה לחקר התחבורה השליה של אנדוגני השונים ותרכובות אקסוגניים ^{3,11,12,18,19} ומגוון רחב של פונקציות אחרות של השליה כמו מנגנונים אחראים ל התפתחות של מצבים פתולוגיים כמו רעלת הריון ^{20-22. בפרוטוקול זה אנו מתמקדים בעיקר להגדיר, טיפול ושיטה המאפשר מחקר של הצטברות, תופעות ושיעורי טרנסלוקציה של מערך רחב של xenobiotics או חלקיקים.}

Protocol

1. הכנת מערכת זלוף

1. להגדיר את מערכת זלוף בהיקף של אמבט מים, חדר זלוף, בשתי עמודות עבור חמצון, שתי משאבות peristaltic, שתי מלכודות בועה, שני תנורי זרימה וחיישן לחץ אחד (איור 1). רכיבים אלה להתחבר עם קטעי צינורות מורכבים מחומרי כלוריד סיליקון ופוליוויניל על פי התכנית באיור 2. סוף סוף יש שני מעגלים המייצגים את המעגל העוברי ואימהי, בהתאמה.
2. הפעל את האמבטיה במים, זרימה ואת תנורי חימום לתא זלוף. הטמפרטורה צריכה להיות 37 מעלות צלזיוס
3. לחמם את מדיום זלוף (NCTC-135 מדיום תרבית רקמת דילול 01:02 עם החיץ של ארל (6.8 גר '/ L נתרן כלורי, אשלגן כלורי 0.4 גר' / ל ', 0.14 גר' / ל 'מונוסודיום פוספט, מגנזיום סולפט 0.2 גר' / ל ', 0.2 גר' / סידן כלוריד L, 2 גרם גלוקוז / L) בתוספת גלוקוז (ז 1 / L), dextran 40 (10 גר '/ ל'), אלבומין בסרום השור (10 גר '/ L), הפרין נתרן (2,500 IU / L), amoxicilline (250 מ"ג / ליטר) וסודיום ביקרבונט (2.2 גר '/ ל'); pH 7.4) באמבט המים.
4. רצף לשטוף את מערכות עורקים של המעגל העוברי ואימהי עם מיליליטר מים מזוקקים 200), ב) 50 הידרוקסיד מיליליטר 1% נתרן, ג) 1% חומצה זרחתית ו-D) שוב מים מזוקקים 200 מ"ל (קצב זרימה: 15 - 20 מ"ל / דקה).
5. חבר את הצינורית העוברית (O 1.2 מ"מ; מחט קהה צריכה להיות מחובר לסט עירוי מחט מכונף שונה) לצינורות דם העוברי.
6. שוטפים את מערכות עורקים של המעגל העוברי ואימהי עם מדיום זלוף עד שכל הצינורות מכילים בינוניים (קצב זרימה: מ"ל / דקה 15-20). במהלך שלב זה למלא את מלכודות הבועה ולהסיר את כל בועות במורד הזרם של המלכודת. אז להפסיק את המשאבות. זה באמת חשוב כי צינורות העורקים מביא תמיד חופשיים של בועות, אחרת אחרי cannulation במיוחד את כלי העובר העדינים יכולים להיקרע.
7. הפעל את זרימת הגז. המעגל האימהי הוא מחומץ wi5% דו תחמוצת הפחמן, וה 95% אוויר סינטטי ומעגל העוברי עם 5% פחמן דו חמצני ו 95% חנקן.
8. התחל את ההקלטה של ​​חיישן הלחץ.

2. Cannulating השליה

1. השג placentae ללא פגע מהריונות מסובכים טווח לאחר ניתוח קיסרי ראשוני. יש הסכמה בכתב שיינתן (הושג במקרה של המחקרים שלנו) על ידי אמהות לפני הלידה ויש המחקר שיאושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (שהיה במקרה במחקרים שלנו). שליטה חזותית ראשונה צריך להיעשות על ידי מיילדות כדי להבטיח שליה בריאה ושלמה.
2. Cannulation של השליה הוא שלב קריטי! במהלך זלוף כל שיבוש קטן ברקמות יכול להוביל לדליפה בין מחזור הדם האימהי ועוברי. יש לשליה להתקבל תוך 30 דקות לאחר לידה.
3. בחר טבורית ללא פגע באזור השולי של השליה ללא הפרעות נראות לעין בצד האימהי. בצלחת כוריוני,לקשור את שני הענפים הקשורים של עורק טבור וריד במעלה הזרם לצד cannulation מאוחר יותר (לכיוון חבל הטבור) על ידי שימוש בחומר תפר כירורגי. הפוך תמיד שני קשרים.
4. Cannulate העורק העוברי הראשונה. עורקי השליה העובריים הם תמיד קטנים יותר ודקים יותר מהוורידים.
5. הפוך תפר סביב העורק העוברי, אבל לא לקשור אותו באופן מיידי. החזק את הכלי עם מלקחיים, לחתוך את הכלי בזהירות ולשים את הצינורית הקטנה (מ"מ Ø 1.2) בעורק. ואז לקשור את התפר (שני קשרים).
6. להמשיך עם הווריד העוברי באותו אופן, אלא להשתמש בצינורית גדולה יותר (O 1.5-1.8 מ"מ; מחט קהה צריכה להיות מחוברת לסט עירוי מחט מכונף שונה).
7. הפעל את משאבת העובר (2 מ"ל / דקה). אם אין נזילה נראית לעין ודם נובע מצינורית הווריד העוברית, להגביר את הזרימה באיטיות עד 4 מ"ל / דקה. שימו לב ללחץ בעורק העובר, זה לא יעלה על 70 מ"מ כספית. אם דולף החוצה נוזל בעובר או בת זוגrnal צינורית לתקן אותם עם תפר אחר.
8. מניחים את השליה על בעל הרקמה העוברי עם הצד ולמשוך את קרום השליה ורקמות על הקוצים. בסופו של טבורית perfused צריכה להיות באמצע החור בבעל הרקמות.
9. לייצב את החלק שבו רק הקרום מחזיק את השליה עם קרום סיליקון (1 מ"מ O) או לחלופין שתי חתיכות parafilm.
10. להרכיב את בעל הרקמה השלם, להדק את הברגים ולחתוך את הרקמה העילית. שים לב שהוורידים והעורקים cannulae לא צבטו אלא שכב בתעלות הקטנות של בעל הרקמה.
11. סובב את בעל הרקמה הפוך, הכניס אותו לתוך תא זלוף ולהוסיף את הכיסוי. עכשיו, בצד האימהי צריך להיות בחלק העליון. בדקו תמיד אם המעגל העוברי עדיין לא נפגע ובינוני זורם מצינור הווריד העוברי.
12. הפעל את המשאבה האימהית (12 מ"ל / דקה). להציג את השלושה הבוטה cannulae (O 0.8 מ"מ) בשעה הסוף הדואר של צינור העורקים האימהי אל תוך חלל intervillous על ידי חדירת צלחת decidual. כדי לחזור perfusate למעגל האימהי לשים צינור ניקוז ורידים כאחד שזה קשור גם עם המשאבה האימהית למיקום הנמוך ביותר בחלקו העליון של תא זלוף.
13. חבר את הצינורית לווריד העוברית וריד הצינור העוברי.

3. ביצוע השלב טרום וניסויית של זלוף

1. כדי לאפשר לרקמות להתאושש מתקופת איסכמי לאחר לידה וכדי לשטוף את הדם בחלל intervillous, שלב טרום פתיחה של 20 דקות היא הכרחית. זה אומר וריד האימהי ועוברי לא מוביל בחזרה למאגר המכיל עורקים בינוניים זלוף. לאסוף את יצוא הוורידים העוברי ואימהי בבקבוק וזורקים אותו לאחר השלב טרום.
2. על מנת להעריך את היושרה של זלוף לבצע עוד לפני שלב של 20 דקות, אבל במעגל סגור. השתמש בשני מאגרים נפרדים עם מדיום זלוףלמעגל העוברי ואימהי ולסגור המעגלים על ידי מוביל יצוא הוורידים העוברי בחזרה במאגר העוברי ויצוא חזרה ורידים האימהי במאגר האימהי.
3. לצורך ניסוי זלוף העיקרי להכין שתי צלוחיות עם 120 מ"ל זלוף בינוני (אחד לאחד האימהית והעוברי למאגר). הוסף ¹⁴ C-antipyrine radiolabeled (4 NCI / מ"ל; משמש כביקורת חיובית; זהירות: חומר רדיואקטיבי) וxenobiotic או חלקיקים שכותרתו fluorescently שאחד רוצה לנתח למאגר האימהי. מערבבים היטב perfusate האימהי.
4. התחל את הניסוי על ידי החלפת מדיום זלוף הטהור עם שתי צלוחיות סיים (מאגרים עובריים ואימהיים). סגור את המעגלים על ידי מוביל יצוא חזרה ורידים העוברי במאגר העוברי ויצוא חזרה ורידים האימהי במאגר האימהי.
5. המשך לזלוף 6 שעות ולקחת דגימות באופן קבוע. תמיד resuspend הבינוני בעובר ואימהימאגר לפני הנסיגה.
6. לשלוט בלחץ בעורק העובר (לא תעלה על 70 מ"מ כספית), pH בשני המעגלים (צריך להיות בטווח פיסיולוגי 7.2-7.4) והנפח של שני מאגרים (אובדן נפח עוברי לא יעלה על 4 מ"ל / שעה) במהלך זלוף . אם יש צורך להתאים את ערכי ה-pH או באמצעות חומצה הידרוכלורית או נתרן הידרוקסידי.
7. אם אובדן הנפח במאגר העובר עולה על 4 מ"ל / שעה יש דליפה ברקמה וצריך לעצור את טפטוף. שיעור ההצלחה של זלוף ל6 שעות ללא דליפה הוא כ 15-20%.
8. לעצור את טפטוף לאחר 6 שעות. לכבות את המשאבות, אמבט מים, תנורי חימום זרימה וזרימת גז.
9. הסר את השליה מבעל הרקמות, לחתוך טבורית perfused (בהירה יותר מרקמות unperfused) ולשקול אותו.
10. לקחת דגימות מunperfused (חלק מהשליה שנחתכה בתחילת; יכול להיות כבר נלקח במהלך השלב טרום) ורקמות perfused (כל גרם על 1) ולאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוסעד הומוגניזציה או בחנקן נוזלי לניתוח מאוחר יותר. תקן את דגימת רקמות אחרת בפורמלין 4% להערכת histopathological. הדגימות צריכה לכלול את כל השכבות של השליה.
11. יש לנקות את הצינורות לאחר זלוף על ידי שטיפה ברציפות מערכות העורקים של המעגל העוברי ואימהי עם מיליליטר מים מזוקקים 200), ב) 50 הידרוקסיד מיליליטר 1% נתרן, ג) 1% חומצה זרחתית 50 מ"ל וד) שוב מים מזוקקים 200 מ"ל (זרימה: מ"ל / דקה 15-20).

הליך העבודה השלם של ניסוי זלוף השליה מתואר באיור 3.

4. ניתוח דוגמאות

1. צנטריפוגה דגימות perfusate עבור 10 דקות ב 800 XG לפני ניתוח כדי להסיר אריתרוציטים שיורית. קח את supernatant לניתוח נוסף. ניתן להשאיר את דגימות לילה בשעה 4 ° C. לניתוח של ייצור הלפטין וhCG ניתן לאחסן את הדגימות ב -20 ° C.
2. כדי להעריך את החדירות שלשליה לנתח ^C-14 antipyrine ידי נצנץ נוזלי. מערבבים 300 μl של הדגימות עובריות ואימהיות עם קוקטייל 3 מיליליטר נצנץ ומדד במשך 5 דקות בדלפק בטא.
3. על מנת להעריך את ההעברה של חלקיקי הניאון או xenobiotic עניין לקרוא את הקרינה בעירור 485 ננומטר ופליטת ננומטר 528 בקורא microplate (אורכי גל שצוין הם לניתוח של התווית הירוקה הצהובה שהיינו לחלקיקים).
4. כדי לקבוע את הכדאיות של רקמת השליה במהלך זלוף מדד צריכת גלוקוז וייצור חומצת החלב במעגל העוברי ואימהי עם מערכת גז דם אוטומטית. בנוסף, להעריך את הייצור של ההורמונים האנושי choriongonadotropin השליה (hCG) ולפטין בדגימות הרקמה הומוגני ואת perfusates ידי assay immunosorbent אנזים צמוד (ELISA).

תוצאות

איור 4 א מציג את פרופילי הטפטוף של חלקיקי פוליסטירן קטנים (80 ננומטר) שהובלו על פני השליה בהשוואה לחלקיקי פוליסטירן גדולים יותר (500 ננומטר), אשר לא הועברו לתא העוברי. כל נקודת נתונים מייצגת את ריכוז החלקיקים הממוצע לנקודת הזמן נתון של לפחות 3 ניסויים בלתי תלויים...

Discussion

מתחת לזלוף הסירקולציה המחודשת הכפול הראה כאן, ישנם מספר תצורות ניסיוניות אחרות אפשריות, תלויות בשאלה אשר צריכה להיות ענה. הזלפות שליה במיוחד פתוחות משמשות בדרך כלל כדי להעריך את אישור התרופה בריכוז המצב יציב ^3. זלוף הסירקולציה המחודשת ההגדרה יכול להיות מיושם ג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCTC-135 medium	ICN Biomedicals, Inc.	10-911-22C	could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769)
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich, Fluka	71381
Potassium chloride (KCl)	Hospital pharmacy		also possible: Sigma (P9541)
Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O)	Merck	106346
Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O)	Sigma-Aldrich, Fluka	63139
Calcium chloride (CaCl, anhydrous)	Merck	102388
D(+) Glucose (anhydrous)	Sigma-Aldrich, Fluka	49138
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck	106329
Dextran from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	31389
Bovine serum albumin (BSA)	Applichem	A1391
Amoxicilline (Clamoxyl)	GlaxoSmithKline AG	2021101A
Sodium heparin	B. Braun Medical AG	3511014
Sodium hydoxide (NaOH) pellets	Merck	106498	CAUTION: corrosive
Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4)	Merck	100573	CAUTION: corrosive
Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2	PanGas AG
Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2	PanGas AG
Antipyrine (N-methyl-14C)	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ARC 0108-50 μCi	CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol)
Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus)	Zinsser Analytic GmbH	1003100
Polystyrene particles 80 nm	Polyscience, Inc.	17150
Polystyrene particles 500 nm	Polyscience, Inc.	17152
EQUIPMENT
Water bath	VWR	462-7001
Thermostat	IKA-Werke GmbH Co. KG	3164000
Peristaltic pumps	Ismatec	ISM 833
Bubble traps (glass)	UNI-GLAS Laborbedarf
Flow heater	UNI-GLAS Laborbedarf
Pressure sensor + Software for analyses	MSR Electronics GmbH	145B5
Notebook	Hewlett Packard
Miniature gas exchange oxygenator	Living Systems Instrumentation	LSI-OXR
Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm)	Ismatec	MF0028
Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm)	Ismatec	SC0744
Blunt cannulae ( 0.8 mm)	Polymed Medical Center	03.592.81
Blunt cannulae ( 1.2 mm)	Polymed Medical Center	03.592.90
Blunt cannulae ( 1.5 mm)	Polymed Medical Center	03.592.94
Blunt cannulae ( 1.8 mm)	Polymed Medical Center	03.952.82
Parafilm	VWR	291-1212
Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass)	Internal technical department		Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK
Surgical suture material (PremiCron)	B. Braun Medical AG	C0026005
Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly)	Hospira, Inc.	ASN 2102
Multidirectional stopcock (Discofix C-3)	B. Braun Medical AG	16494C
Surgical scissors	B. Braun Medical AG	BC304R
Dissecting scissors	B. Braun Medical AG	BC162R
Needle holder	B. Braun Medical AG	BM200R
Dissecting forceps	B. Braun Medical AG	BD215R
Automated blood gas system	Radiometer Medical ApS	ABL800 FLEX
Multi-mode microplate reader	BioTek	Synergy HT
Liquid scintillation analyzer	GMI, Inc.	Packard Tri-Carb 2200
Scintillation tubes 5.5 ml	Zinsser Analytic GmbH	3020001
Tissue Homogenizer	OMNI, Inc.	TH-220
pH meter + electrode	VWR	662-2779