Determinazione del tasso di trasporto di xenobiotici e nanomateriali attraverso la placenta con il<em&gt; Ex vivo</em&gt; Umano Modello perfusione placentare

Riepilogo

Gli Ex vivo Dual ricircolo modello perfusione placentare umano può essere usato per studiare il trasferimento di xenobiotici e nanoparticelle attraverso la placenta umana. In questo protocollo video si descrive l'attrezzatura e le tecniche necessarie per una corretta esecuzione di un perfusione placentare.

Abstract

Decenni fa, la placenta umana è stato pensato per essere una barriera impenetrabile tra madre e feto. Tuttavia, la scoperta di difetti alla nascita talidomide-indotta e molti studi successivi seguito si mostrò il contrario. Oggi diversi xenobiotici nocivi come la nicotina, eroina, metadone o droghe, nonché agenti inquinanti ambientali sono stati descritti per superare questa barriera. Con il crescente uso della nanotecnologia, la placenta rischia di entrare in contatto con nuove nanoparticelle sia accidentalmente attraverso l'esposizione o intenzionalmente, nel caso di potenziali applicazioni nanomedical. I dati provenienti da esperimenti su animali non possono essere estrapolati per l'uomo perché la placenta è la più specie-specifico organo dei mammiferi ^1. Pertanto, l'ex vivo doppio ricircolo di perfusione placentare umano, sviluppato da Panigel et al. Nel 1967 ² e continuamente modificato da Schneider et al. Nel 1972 ^3, può servire come un eccellente modello di tØ studiare il trasferimento di xenobiotici o particelle.

Qui, ci concentriamo sul duplice ex vivo a ricircolo di protocollo di perfusione placentare umano e il suo ulteriore sviluppo per acquisire risultati riproducibili.

La placenta sono stati ottenuti dopo il consenso informato delle madri di gravidanze non complicate termine sottoposti a parto cesareo. I vasi fetali e materni di un cotiledone intatto stati cannulati e perfusi almeno per cinque ore. Come un modello di particelle particelle di polistirene fluorescente con dimensioni di 80 e 500 nm di diametro sono stati aggiunti al circuito materna. Le 80 particelle nm sono stati in grado di attraversare la barriera placentare e fornire un esempio perfetto per una sostanza che viene trasferita attraverso la placenta al feto, mentre le particelle di 500 nm sono stati mantenuti nel tessuto placentare o circuito materna. Il modello di perfusione ex vivo umano placentare è uno dei pochi modelli che forniscono informazioni attendibili suil comportamento di trasporto di xenobiotici in una importante barriera tessuto che fornisce i dati rilevanti predittivi e clinici.

Introduzione

La placenta è un organo complesso che è responsabile per lo scambio di ossigeno, anidride carbonica, nutrienti e prodotti di scarto e allo stesso tempo in grado di mantenere i due circuiti di sangue della madre e la crescita del feto separati tra loro. Inoltre, impedisce il rifiuto del figlio da parte del sistema immunitario materno e secerne ormoni per mantenere la gravidanza. La barriera cellulare si forma dalle cellule cytotrophoblast che si fondono e formano un vero sincizio senza membrane cellulari laterali ^4,5. Tutta la placenta è organizzato in diversi cotiledoni, che contengono un albero dei villi fetali e rappresentano una unità funzionale della placenta.

Lo studio della funzione di barriera placentare è stata intensificata con la scoperta delle malformazioni indotte talidomide nel 1960. Per ovvie ragioni non possono essere eseguiti studi traslocazione con le donne in gravidanza. Di conseguenza, vari modelli alternativi sono stati sviluppati ^6,7 . Il modello in questione più promettente e probabilmente più clinico è il modello ex vivo umano placentare perfusione sviluppato da Panigel e collaboratori ^2,3.

Molte donne sono esposte a diversi xenobiotici quali farmaci o sostanze inquinanti ambientali durante la gravidanza ^8. Per alcuni farmaci che sono stati già somministrati regolarmente durante la gravidanza, studi in vivo può essere eseguita confrontando la concentrazione ematica materna con quella nel sangue del cordone ombelicale. Tuttavia, in genere ci sono solo informazioni limitate sulla farmacocinetica e-dinamica nel feto e la teratogenicità di tali sostanze.

Per esempio gli oppiacei come l'eroina attraversa facilmente la barriera placentare e può portare alla restrizione della crescita intrauterina, parto prematuro o aborto spontaneo ^9,10. Quindi, in caso di astinenza mancante durante la gravidanza si raccomanda una terapia sostitutiva con metadone. L'exvivo modello perfusione placentare umano ha rivelato che il trasferimento di metadone nella circolazione fetale è trascurabile ^11, che correla bene con la-a-sangue materno rapporto di concentrazione calcolata cordone sangue dopo la consegna ^12.

La nanotecnologia è un settore in crescita soprattutto in medicina. Così, sotto la naturale fine (<2,5 micron di diametro) e le particelle ultrafini (<0,1 micron di diametro) nei fumi degli incendi boschivi, eruzioni vulcaniche e in polvere del deserto, l'esposizione a nanomateriali ingegnerizzati (almeno una dimensione <0,1 micron ¹³ ) è in aumento. Questo ha sollevato interrogativi circa il potenziale tossicologico di nanomateriali ingegnerizzati. Anche se nessun pericolo umana potrebbe essere ancora dimostrata, ci sono i principali studi sperimentali indicano che le nanoparticelle ingegnerizzate possono causare reazioni avverse biologici che portano a risultati tossicologici ^14. Recentemente, alcuni studi hanno indicato che l'esposizione prenatale ainquinamento dell'aria è collegato ad un bisogno respiratorio superiore e infiammazione delle vie aeree in neonati e bambini ^15,16. Inoltre, le piccole nanoparticelle potrebbero essere utilizzati come trasportatori di farmaci per trattare specificamente, sia il feto o la madre. Pertanto, diventa evidente che sono necessari studi approfonditi di xenobiotici distinti o nanomateriali e la loro capacità di attraversare la barriera placentare. Una panoramica reale sugli studi in corso sulla permeabilità placentare di nanomateriali ingegnerizzati è riassunto nella Menezes et al. 2011 ¹⁷ e Buerki-Thurnherr et al. 2012 ^7.

La doppia ex vivo ricircolazione modello perfusione placentare umano fornisce un sistema controllato e affidabile per studiare il trasporto placentare di vari composti endogeni ed esogeni ^{3,11,12,18,19} e una vasta gamma di altre funzioni della placenta come meccanismi responsabili della sviluppo di stati patologici come preeclampsia ^{20-22. In questo protocollo ci concentriamo principalmente sul set up, la gestione e il metodo che permette lo studio di accumulo, effetti e tassi di traslocazione di un ampio set di xenobiotici o nanoparticelle.}

Protocollo

1. Preparazione del sistema di perfusione

1. Configurare il sistema di perfusione costituito da un bagno d'acqua, una camera di perfusione, due colonne per l'ossigenazione, due pompe peristaltiche, due trappole bolla, due riscaldatori di flusso e un sensore di pressione (Figura 1). Collegare questi componenti con sezioni di tubi composti di materiali siliconici e cloruro di polivinile secondo lo schema della figura 2. Infine ci sono due circuiti che rappresentano rispettivamente il circuito fetale e materna.
2. Accendere il bagno d'acqua, i riscaldatori di flusso ed il riscaldamento per la camera di perfusione. La temperatura dovrebbe essere di 37 ° C.
3. Riscaldare il fluido di perfusione (NCTC-135 coltura tissutale diluito 1:2 con tampone di Earle (6,8 g / l di cloruro di sodio, 0,4 g / l di cloruro di potassio, 0,14 g / L di fosfato monosodico, 0,2 g / L di magnesio solfato, 0,2 g / l di cloruro di calcio, 2 g / L di glucosio) supplementato con glucosio (1 g / L), destrano 40 (10 g / L), sieroalbumina bovina (10 g/ L), eparina sodica (2,500 IU / L), amoxicillina (250 mg / L) e bicarbonato di sodio (2,2 g / L); pH 7.4) nel bagnomaria.
4. Consecutivamente sciacquare i sistemi arteriosa del circuito fetale e materno with a) 200 ml di acqua distillata, b) 50 ml di idrossido di sodio 1%, c) 1% acido fosforico ed) ancora 200 ml di acqua distillata (portata: 15 - 20 ml / min).
5. Collegare la cannula fetale (Ø 1,2 millimetri; ago smussato deve essere collegata a un alato set di infusione ago modificato) per il tubo arterioso fetale.
6. Sciacquare i sistemi arteriosa del circuito fetale e materno con il mezzo di perfusione finché tutte le provette contengano medie (portata: 15-20 ml / min). Durante questa fase riempire le trappole bolla e rimuovere tutte le bolle a valle della trappola. Poi fermare le pompe. E 'davvero importante che i tubi arteriosi afferenti sono sempre liberi di bolle, altrimenti dopo incannulamento soprattutto le belle vasi fetali possono rompersi.
7. Accendere il flusso di gas. Il circuito materna è ossigenato with 5% di anidride carbonica e aria sintetica 95% e il circuito fetale con il 5% di biossido di carbonio e 95% di azoto.
8. Avviare la registrazione del sensore di pressione.

2. Cannulating la Placenta

1. Ottenere placenta intatta da gravidanze non complicate termine dopo il taglio cesareo primario. Consenso scritto deve essere data (è stato ottenuto nel caso dei nostri studi) dalle madri prima della consegna e lo studio deve essere approvato dal comitato etico locale (è stato il caso nei nostri studi). Primo controllo visivo deve essere effettuato da ostetriche per assicurare una placenta sana e intatta.
2. Incannulamento della placenta è un passaggio fondamentale! Durante la perfusione ogni piccola perturbazione nel tessuto può portare ad una perdita tra la circolazione materna e fetale. La placenta deve essere ottenuto entro 30 minuti dopo la consegna.
3. Selezionare un cotiledone intatto nella zona marginale della placenta senza interruzioni visibili sul lato materno. Alla piastra corionica,legare entrambi i rami collegati al dell'arteria ombelicale e vena a monte al lato incannulazione tardi (verso il cordone ombelicale) utilizzando materiale di sutura chirurgica. Fai sempre due nodi.
4. Incannulare l'arteria fetale prima. Le arterie placentari fetali sono sempre più piccoli e più sottili delle vene.
5. Fai una sutura intorno all'arteria del feto, ma non legarlo immediatamente. Tenere il recipiente con una pinza, tagliare accuratamente il vaso e mettere la piccola cannula (Ø 1,2 mm) in arteria. Poi legare la sutura (due nodi).
6. Procedere con la vena fetale nello stesso modo, ma usare una cannula più grande (Ø 1,5-1,8 mm; ago smussato deve essere collegata a un alato set di infusione ago modificato).
7. Accendere la pompa fetale (2 ml / min). Se non ci sono perdite visibili e sangue emana dalla cannula vena fetale, aumentare lentamente il flusso fino a 4 ml / min. Osservare la pressione nell'arteria fetale, non dovrebbe superare i 70 mmHg. Se il liquido che fuoriesce al feto o di maternal cannula fissarli con un altro sutura.
8. Posizionare la placenta sul supporto del tessuto con il lato fetale e tirare la membrana placentare e tessuto sopra le punte. Alla fine il cotiledone perfuso dovrebbe essere al centro del foro nel supporto del tessuto.
9. Stabilizzare la parte dove solo la membrana contiene la placenta con una membrana di silicone (Ø 1 mm) o in alternativa ai due pezzi parafilm.
10. Montare il supporto del tessuto completo, stringere le viti e tagliare il tessuto sovrastante. Si prega di notare che il venoso e arterioso cannule non vengano schiacciati, ma invece giacevano nei piccoli canali del supporto del tessuto.
11. Ruotare il supporto del tessuto a testa in giù, metterlo nella camera di perfusione e di aggiungere la copertina. Ora, il lato materno dovrebbe essere al top. Controllare sempre se il circuito del feto è ancora intatta e il mezzo sta fluendo fuori del tubo vena fetale.
12. Accendere la pompa di materna (12 ml / min). Introdurre i tre smussato cannule (Ø 0.8 mm) e al secoloe estremità del tubo arteria materna nello spazio intervilloso penetrando la piastra deciduali. Per riportare il perfusato al circuito materna messo una provetta come drenaggio venoso anch'esso collegato con la pompa materna nella posizione più bassa nella parte superiore della camera di perfusione.
13. Collegare la cannula venosa fetale al tubo vena fetale.

3. L'esecuzione della fase di pre-e Sperimentale di perfusione

1. Per consentire al tessuto di recuperare dal periodo ischemico dopo la consegna e per scovare il sangue nello spazio intervilloso, un open di pre-fase di 20 min è necessario. Ciò significa che la vena materna e fetale non stanno portando al serbatoio arteriosa contenente il medium di perfusione. Raccogliere il deflusso venoso fetale e materna in una bottiglia e gettarla via dopo la prima fase.
2. Per valutare l'integrità della perfusione eseguire un'altra pre-fase di 20 min, ma in un circuito chiuso. Utilizzare due serbatoi separati con il mezzo di perfusioneper il circuito fetale e materna e chiudere i circuiti guidando il deflusso venoso fetale torna nel serbatoio fetale e materno venoso torna nel serbatoio materna.
3. Per l'esperimento perfusione principale preparare due beute da 120 ml di mezzo di perfusione (una per la materna e una per il serbatoio fetale). Aggiungere la radiomarcato ¹⁴ C-antipyrine (4 nCi / ml; serve come controllo positivo; ATTENZIONE: sostanza radioattiva) e la xenobiotici o nanoparticelle fluorescente che si vuole analizzare al serbatoio materna. Mescolare bene il perfusato materna.
4. Avviare l'esperimento scambiando il medium di perfusione puro con i due palloni preparati (serbatoi fetale e materna). Chiudere i circuiti guidando il feto venoso torna nel serbatoio fetale e materno venoso torna nel serbatoio materna.
5. Continuare la perfusione per 6 ore e prelevare campioni regolarmente. Risospendere sempre il mezzo nel fetale e maternaserbatoio prima del ritiro.
6. Controllare la pressione in arteria fetale (non dovrebbe superare i 70 mmHg), pH in entrambi i circuiti (dovrebbe essere in un range fisiologico 7.2-7.4) e il volume di entrambi i serbatoi (perdita di volume fetale non deve superare 4 ml / hr) durante la perfusione . Se necessario regolare i valori di pH utilizzando sia l'acido cloridrico o idrossido di sodio.
7. Se la perdita di volume nel serbatoio fetale supera 4 ml / hr c'è una perdita nel tessuto e si deve interrompere la perfusione. Il tasso di successo di una perfusione per 6 ore senza perdita è di circa il 15-20%.
8. Fermare la perfusione dopo 6 ore. Spegni le pompe, bagno d'acqua, riscaldatori di flusso e flusso di gas.
9. Rimuovere la placenta dal supporto del tessuto, tagliare il cotiledone perfuso (più luminoso del tessuto unperfused) e si pesa.
10. Prelevare campioni da unperfused (parte della placenta che è stato tagliato in principio; potrebbe essere già in fase di pre-fase) e perfusione tissutale (ciascuna di circa 1 g) e conservarli a -20 ° Cfino omogeneizzazione o in azoto liquido per la successiva analisi. Fissare un altro campione di tessuto in formalina 4% per la valutazione istopatologica. I campioni dovrebbero comprendere tutti gli strati della placenta.
11. Pulire le provette dopo perfusione ordine successivo risciacquo sistemi arteriosa del circuito fetale e materno con a) 200 ml di acqua distillata, b) 50 ml di idrossido di sodio 1%, c) 50 ml di 1% di acido fosforico e d) di nuovo 200 ml di acqua distillata (flusso: 15-20 ml / min).

L'intera procedura di lavoro dell'esperimento perfusione placenta è mostrata in Figura 3.

4. Analizzando i campioni

1. Centrifugare i campioni perfusato per 10 min a 800 xg prima dell'analisi per rimuovere residui eritrociti. Prendete il surnatante per l'ulteriore analisi. I campioni possono essere lasciati notte a 4 ° C. Per l'analisi della produzione di leptina e hCG i campioni possono essere conservati a -20 ° C.
2. Per valutare la permeabilità delplacenta analizzare il ^C-14 antipyrine da scintillazione liquida. Mescolare 300 ml di campioni fetali e materni con 3 ml di cocktail di scintillazione e misura per 5 minuti in un contatore beta.
3. Per valutare il trasferimento delle nanoparticelle fluorescenti o xenobiotici di interesse leggere la fluorescenza a 485 nm di eccitazione e di emissione di 528 nm in un lettore di micropiastre (lunghezza d'onda sono indicati per l'analisi del marchio verde giallo che abbiamo usato per le nanoparticelle).
4. Per determinare la fattibilità del tessuto placentare durante la perfusione misura il consumo di glucosio e la produzione di lattato nel circuito fetale e materno con un sistema automatizzato di gas del sangue. Inoltre, valutare la produzione di ormoni placentare umano choriongonadotropin (hCG) e leptina nei campioni di tessuto omogeneizzati e le perfusati by enzyme-linked test immunoenzimatico (ELISA).

Risultati

La Figura 4A mostra i profili di perfusione di piccole particelle di polistirene (80 nm) che sono stati trasportati attraverso la placenta più grandi rispetto a particelle di polistirene (500 nm), che non sono state trasferite al compartimento fetale. Ciascun punto di dati rappresenta la concentrazione di particella medio al dato punto di almeno tre esperimenti indipendenti tempo. Per polistirolo nanoparticelle il trasferimento placentare è formato-dipendente ^19. Dopo 3 h di placenta perfus...

Discussione

Sotto il duplice perfusione ricircolo mostrato qui, ci sono diverse altre configurazioni sperimentali possibili a seconda della questione che deve essere risolta. Perfusione placentare particolarmente aperta sono comunemente utilizzati per valutare la clearance del farmaco a concentrazioni steady-state ^3. La perfusione ricircolo set-up può essere applicato anche per confermare trasporto attivo di sostanze endogene o esogene. Per questo approccio la stessa concentrazione del xenobiotici deve essere aggiunto a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCTC-135 medium	ICN Biomedicals, Inc.	10-911-22C	could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769)
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich, Fluka	71381
Potassium chloride (KCl)	Hospital pharmacy		also possible: Sigma (P9541)
Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O)	Merck	106346
Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O)	Sigma-Aldrich, Fluka	63139
Calcium chloride (CaCl, anhydrous)	Merck	102388
D(+) Glucose (anhydrous)	Sigma-Aldrich, Fluka	49138
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck	106329
Dextran from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	31389
Bovine serum albumin (BSA)	Applichem	A1391
Amoxicilline (Clamoxyl)	GlaxoSmithKline AG	2021101A
Sodium heparin	B. Braun Medical AG	3511014
Sodium hydoxide (NaOH) pellets	Merck	106498	CAUTION: corrosive
Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4)	Merck	100573	CAUTION: corrosive
Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2	PanGas AG
Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2	PanGas AG
Antipyrine (N-methyl-14C)	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ARC 0108-50 μCi	CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol)
Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus)	Zinsser Analytic GmbH	1003100
Polystyrene particles 80 nm	Polyscience, Inc.	17150
Polystyrene particles 500 nm	Polyscience, Inc.	17152
EQUIPMENT
Water bath	VWR	462-7001
Thermostat	IKA-Werke GmbH Co. KG	3164000
Peristaltic pumps	Ismatec	ISM 833
Bubble traps (glass)	UNI-GLAS Laborbedarf
Flow heater	UNI-GLAS Laborbedarf
Pressure sensor + Software for analyses	MSR Electronics GmbH	145B5
Notebook	Hewlett Packard
Miniature gas exchange oxygenator	Living Systems Instrumentation	LSI-OXR
Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm)	Ismatec	MF0028
Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm)	Ismatec	SC0744
Blunt cannulae ( 0.8 mm)	Polymed Medical Center	03.592.81
Blunt cannulae ( 1.2 mm)	Polymed Medical Center	03.592.90
Blunt cannulae ( 1.5 mm)	Polymed Medical Center	03.592.94
Blunt cannulae ( 1.8 mm)	Polymed Medical Center	03.952.82
Parafilm	VWR	291-1212
Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass)	Internal technical department		Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK
Surgical suture material (PremiCron)	B. Braun Medical AG	C0026005
Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly)	Hospira, Inc.	ASN 2102
Multidirectional stopcock (Discofix C-3)	B. Braun Medical AG	16494C
Surgical scissors	B. Braun Medical AG	BC304R
Dissecting scissors	B. Braun Medical AG	BC162R
Needle holder	B. Braun Medical AG	BM200R
Dissecting forceps	B. Braun Medical AG	BD215R
Automated blood gas system	Radiometer Medical ApS	ABL800 FLEX
Multi-mode microplate reader	BioTek	Synergy HT
Liquid scintillation analyzer	GMI, Inc.	Packard Tri-Carb 2200
Scintillation tubes 5.5 ml	Zinsser Analytic GmbH	3020001
Tissue Homogenizer	OMNI, Inc.	TH-220
pH meter + electrode	VWR	662-2779